Nanoconductos biohíbridos en membranas poliméricas de poros perfectos
Resumen
Las membranas poliméricas de poros/conductos perfectos, son estudiadas desde 1970 y se comercializan desde hace tres década, siendo los principales campos de aplicación la filtración, purificación y análisis de partículas en aire. No obstante, la evolución de la nanotecnología permitió desarrollar membranas con mejores rendimientos, nuevas funcionalidades y aplicaciones, como por ejemplo, en biocatálisis, separación selectiva de moléculas, detección de moléculas, biosensores y molde para construir otras estructuras nanométricas.
Por otro lado, el polietilentereftalato (PET) es un polímero que se caracteriza por tener una gran resistencia a agentes químicos, excelentes propiedades ópticas, bajos costos de fabricación, es biocompatible, hemocompatible y antimicrobiano, que lo hacen útil para diversas aplicaciones biológicas.
Dentro de este contexto, se presenta en este trabajo la preparación de membranas poliméricas de PET con nanoporos perfectos funcionalizados. Se estudió la preparación de membranas tipo track-etched mediante el proceso de grabado químico, evaluándose el efecto de las variables del proceso (temperatura, concentración del álcali, tiempo de incubación y el pre tratamiento con luz UV). Se realizó la caracterización de las mismas mediante diferentes técnicas fisicoquímicas. Todas las variables estudiadas afectaron el diámetro final de los poros. Se obtuvieron membranas con poros de diámetro en un rango de 25 nm a 500 nm, con una distribución muy homogénea. Asimismo, las micrografías obtenidas por FESEM de cortes transversales de la membrana, permitieron determinar que los nanoconductos formados son cilíndricos y atraviesan toda la membrana, como se había predicho en base a las simulaciones usando el código computacional SRIM.
Para realizar estudios funcionales se desarrolló ad-doc un dispositivo de microceldas (MCD), con el fin de evaluar el transporte de masa sobre estas membranas. A través de este estudio se logró determinar una condición óptima de grabado químico, para la cual se obtienen membranas con un transporte óptimo.
Se estudió la modificación de los nanoconductos con el monómero glicidil metacrilato (GMA), mediante dos métodos distintos de polimerización por injerto: la polimerización simultánea radioinducida y la polimerización iniciada por radicales remanentes. Para detectar el injerto introducido se desarrolló una nueva técnica indirecta de cuantificación por marcación fluorescente, de muy alta sensibilidad, que involucra la derivatización química y marcación fluorescente. La fluorometría y microscopía confocal permitieron estudiar las modificaciones de los nanoconductos con suficiente sensibilidad, logrando así revelar la presencia del injerto introducido, cuantificarlo y determinar la localización específica del mismo sobre las paredes internas de los nanoconductos. Otros estudios funcionales, como transporte de masa y espectroscopia de la impedancia electroquímica, permitieron aseverar que se logró introducir una mínima modificación superficial del conducto con pGMA y este no afecta al transporte, ni obstruye el paso de moléculas ni iones a través de este.
Se investigó la funcionalización del injerto de pGMA con ligandos de bajo PM, con diferentes carga electrostática (cisteamina, B-mercaptoetanol y ácido. tioglicólico), con el objetivo de preparar nanoconductos iónicos y evaluar la permeación selectiva. La caracterización de estas membranas se realizó mediante el estudio de transporte de masa y de espectroscopia de la impedancia, ambas técnicas se utilizan para evaluar el comportamiento del transporte en estructuras nanométricas. Se lograron medir diferencias entre el comportamiento de las membranas funcionalizadas, principalmente de las membranas con carga (+) funcionalizada con cisteamina y la de carga (-) funcionalizada con ácido tioglicólico. Los resultados obtenidos confirman que se logró funcionalizar el injerto de pGMA, ubicado en las paredes internas de los nanoconductos y que el ligando incorporado cambia las propiedades de los mismos.
Se profundizó en el estudio de la funcionalización, con ligandos de alto PM, con distintas proteínas como la GFP, GFP-Cis1 y B-Lactamasa, con el fin de utilizarlos como sistemas biohíbridos y su aplicación potencial como sistema biosensor o biocatalizador. Para ello, la funcionalización se realizó mediante reacciones de inmovilización covalente, de tipo monopuntual (reacción epoxi-tiol) y de tipo multipuntual (reacción glutaraldehído/amino). En ambos casos se logró la inmovilización. De la comparación de ambas técnicas se demostró que la inmovilización coval ente de tipo multipuntual fue la más eficiente.
Los diferentes sistemas preparados (polímero-proteína) se caracterizaron en base a su potencial aplicación final, evaluándose la respuesta de los sistemas frente a cambios en las condiciones del entorno. Además se realizó lo mismo con la proteína libre para poder comparar los resultados.
El sistema membrana-GFP tuvo un perfil de respuesta similar al de la proteína libre, frente a los cambios de pH. La buena respuesta a los cambios de pH del medio permite que se lo considere como un potencial sensor fluorométrico de pH. Mientras, que el sistema Memb- β -Lactamasa presentó una muy buena estabilidad de almacenamiento a 8°C, en comparación a la altísima reducción de la enzima libre.
En este trabajo se describe por primera vez la modificación de membranas PET, a través de una técnica sitio específica de modificación de polimerización vía radicales remanentes, que no requiere de agentes químicos adicionales y de la cual no hay precedentes en literatura. Se obtuvieron sistemas biohíbridos enzimáticos o fluorescentes para aplicaciones potenciales como biosensor de pH y enzimático.
Este trabajo pionero abre las puertas para el desarrollo de nuevas aplicaciones de las membranas track-etched a través de nuevas funcionalidades que pueden sumarse a las ya conocidas propiedades de transporte.