Modulación de la sincronización fótica del reloj circadiano en mamíferos

Abstract

Desde el origen de la vida en la Tierra, todos los organismos vivos han estado evolucionando bajo una fuerte presión de selección: el ciclo de luz/oscuridad de 24 h de duración. Este hecho generó que durante la evolución surgiera un sistema que permitiese a los organismos ajustarse temporalmente (sincronizarse) a esta oscilación lumínica de 24 h: el sistema circadiano. Los ritmos circadianos son oscilaciones de aproximadamente 24 h de período, que pueden ser evidenciadas en todos los niveles de organización biológica. El sistema circadiano en los mamíferos, consiste de: i. un reloj central cerebral localizado en los núcleos supraquiasmáticos del hipotálamo (NSQ), que genera y sincroniza los ritmos; ii. vías eferentes que transmiten señales neurohumorales desde este reloj central, imponiendo una periodicidad circadiana sobre el resto del organismo; y iii. vías aferentes que detectan y transmiten claves temporales para la sincronización del reloj. Estas claves son tanto de naturaleza endógena (p. ej., feedbacks hormonales, metabólicos) como exógena (ambientales), siendo la luz la más importante para sincronizar al reloj central. En organismos con organización jerárquica como los mamíferos, la sincronización por luz del reloj central cerebral mantiene una homeostasis fisiológica circadiana coordinando temporalmente osciladores periféricos del organismo. Para poder estudiar la respuesta del sistema circadiano, es necesario analizar las salidas rítmicas fisiológicas y comportamentales del reloj, como por ejemplo el ciclo de actividad/reposo. Los hámsters realizan una gran actividad volitiva en rueda, permitiendo obtener muy buenos registros de esta variable en series temporales que son observadas en actogramas. Bajo ciclos artificiales de 14 h luz: 10 h oscuridad (LO 14:10) en el laboratorio, estos animales son nocturnos. Típicamente en la naturaleza los roedores nocturnos salen y entran de su cueva durante la noche evitando exponerse a depredadores (mayormente diurnos en el curso evolutivo). Tanto en condiciones de laboratorio, como en la naturaleza, el sistema circadiano se encuentra sincronizado al ciclo lumínico exógeno. En cambio, cuando los animales son mantenidos en condiciones de oscuridad constante (OO), el reloj biológico endógeno pierde las claves temporales sincronizadoras del ciclo de LO y entra en libre curso, Fernando Martín Baidanoff - 2017 7 siendo el propio reloj endógeno el que mantiene el ciclo de actividad/reposo. En estas condiciones, pueden administrarse estimulaciones lumínicas breves [pulsos de luz (PL)], simulando los crepúsculos naturales, para modificar la actividad del reloj circadiano y estudiar su capacidad de sincronización. La sincronización fótica del reloj biológico en mamíferos se entiende fácilmente si se traza el paralelismo con poner en hora un reloj analógico. Mover hacia adelante o hacia atrás las agujas del reloj biológico, se logra adelantando o retrasando la fase de su oscilación circadiana endógena. Retrasos y adelantos de fase del ritmo circadiano de actividad locomotora de hamsters son generados por PL durante la noche subjetiva temprana o tardía, respectivamente. Este protocolo experimental permite analizar la acción de diferentes agentes farmacológicos sobre la sincronización fótica de mamíferos. La cascada de transducción de señales involucrada en la sincronización por luz requiere la activación de la Óxido Nítrico Sintasa neuronal (nNOS) y el incremento en los nivles de Óxido Nítrico (NO). Sin embargo, río debajo de ésta enzima, la vía se bifurca: en el caso de los adelantos, el NO intra- y extracelular activa Guanilato Ciclasa soluble (sGC) causando un incremento de guanosil monofosfato cíclico (cGMP); mientras que para los retrasos de fase, el NO genera la apertura del receptor de Rianodina tipo II (RyRII) del retículo endoplasmático, cumpliendo un rol exclusivamente intracelular e independiente de cGMP. Estas dos vías del NO son las comúnmente conocidas como vía dependiente e independiente de cGMP, que para el caso de la sincronización del reloj central, coincide con una vía extracelular o intracelular del NO, respectivamente. Estudios en otras estructuras cerebrales proponen que la acción dual de la nNOS estaría relacionada con la capacidad de generar tanto NO (mensajero gaseoso) como Glutatión-S-nitrosilado (GSNO), éste último generaría la apertura del RyRII por Snitrosilación (y oxidación) de cisteínas conservadas del receptor. En contraste, la activación inicial de la sGC se logra mediante la coordinación por parte del NO del grupo hemo en el sitio activo de la enzima. Uno de los principales objetivos de esta tesis es contribuir en el conocimiento de los componentes moleculares participantes de la cascada de transducción de señales fóticas, lo cual permite establecer blancos para nuevos fármacos capaces de modular Fernando Martín Baidanoff - 2017 8 la sincronización del reloj (cronobióticos). Con este objetivo, se han empleado diversos compuestos, evaluando sus efectos sobre los cambios de fase inducidos por pulsos de luz, o en protocolos de resincronización al ciclo LO (jet lag), analizando también su efecto a nivel del reloj central molecular. El capítulo 1 consiste en la evaluación de las propiedades cronobióticas de un dador novedoso de NO gaseoso [radical (●NO)], N-nitroso-melatonina (NOMel). La administración periférica de NOMel potenció los adelantos de fase inducidos por luz en animales en OO y aceleró la tasa de resincronización en modelos de jet lag (cambios del ciclo de LO), sin tener efecto sobre la vía de los retrasos. A nivel del reloj central, se demostró que esta potenciación fótica induce una mayor expresión de la proteína reloj PERIOD1 (PER1) en los NSQ. Los efectos de este dador exógeno de NO, se mantuvieron al inhibir la síntesis de novo de NO por co-administración central de LNAME. La medición de los metabolitos del NO (nitritos y nitratos) en homogenatos de NSQ luego de la administración de NOMel permite corroborar la función de dador de ●NO a nivel central de esta droga, y descartar un efecto de biodistribución diferencial en la administración en la noche temprana vs. tardía. En contraste con lo anteriormente publicado por nuestro grupo con S-nitroso-acetilpenicilamida (SNAP), NOMel sólo potenció la vía de los adelantos, es decir, la vía dependiente de cGMP y del ●NO como mensajero extracelular. En el capítulo 2, se estudió por administraciones i.c.v. (intra-cerebro-ventriculares) la capacidad cronobiótica del agente antioxidante N-acetil-L-cisteína (LNAC) y de otros dadores nitrérgicos con distinta tiofilicidad y capacidad oxidativa: Sal de Angeli (SA) un dador de nitroxil (NO- ), y GSNO, un dador de ●NO y trans-S-nitrosilador. El agente antioxidante LNAC atenuó tanto los adelantos como los retrasos de fase inducidos por luz, probablemente su descripto accionar como agente des-S-nitrosilador y/o scavenger de NO/GSNO podría estar interviniendo en ambas cascadas de transducción de señales. Por el contrario, GSNO potenció tanto los adelantos como los retrasos de fases inducidos por luz. Sin embargo, SA mostro potenciar exclusivamente los adelantos de fase. De esta manera, GSNO se asemeja al ya descripto accionar de SNAP, promoviendo tanto la apertura del RyRII (por S-nitrosilación) como la activación de sGC Fernando Martín Baidanoff - 2017 9 (por ●NO). Por el contrario, la SA se comportó como NOMel, potenciando solamente la vía de adelantos dependiente de ●NO. Una diferencia importante observada entre los dadores de ●NO y el de NO- , fue la inducción farmacológica de cambios de fase per se. Es decir, animales que no recibieron un pulso de luz, mostraron retrasos de fase cuando recibieron SA, en contraste con NOMel, GSNO e incluso SNAP, los cuales no inducen cambios de fase por si solos. Los retrasos de fase per se también fueron observados por la administración i.c.v. del antioxidante LNAC. A saber, en los últimos años se ha puesto en evidencia ritmos circadianos en diferentes componentes del estado redox, íntimamente relacionado con el estado metabólico del organismo. La medición del par redox glutatión reducido/oxidado (GSH/GSSG) en homogenatos de NSQ de hámsters realizada en este trabajo, permitió confirmar que el propio reloj central presenta un aumento del estado oxidado en la noche subjetiva tardía de este compuesto. Se hipotetiza entonces que la inyección i.c.v. de LNAC al comienzo de la actividad generaría un retraso en el ritmo circadiano redox, retrasando así toda la maquinaria del reloj. Si bien aún no comprendemos cuál es el mecanismo, ensayos preliminares por inmunohistoquímica muestran la inducción de PER1 en neuronas de los NSQ por tratamiento con LNAC, como correlato de la posible acción antioxidante de la droga en el ajuste del reloj molecular central. Finalmente, el capítulo 3 se focaliza en establecer si el estado redox podría modular el reloj circadiano molecular a nivel post-traduccional, a través de oxidaciones por Snitrosilación en proteínas reloj. Mediante ensayos in vitro (células HEK transfectadas con pCMV Sport2 mPer2) y utilizando la técnica de biotin-switch, hallamos Snitrosilaciones en PER2. A su vez, tanto para PER2 como para BMAL1 (otra proteína reloj) se corroboraron modificaciones post-traduccionales por oxidación de cisteínas que afectan su comportamiento in vitro por generación de homodímeros y agregados. Ensayos preliminares in vivo corroboran la presencia de homodímeros de BMAL1 en muestras de cerebro de ratón. Estos ensayos permiten suponer una regulación redox sobre la propia dinámica del reloj molecular. Se adjunta además un ANEXO con el análisis in sílico de la secuencia aminoacídica y de la estructura de PER2, que permite Fernando Martín Baidanoff - 2017 10 arribar a cisteínas candidatas alojadas en los dominios PAS (Per-Arnt-Sim) de homo y heterodimerización, los cuales son claves para el funcionamiento del reloj molecular. Para finalizar, se propone un modelo que relaciona los cambios en el estado redox con la CRF fótica: el hecho de que exista un estado redox que oscila, le permitiría al reloj central, frente a un mismo estímulo, disparar diferentes cascadas de transducción de señales. Es decir, la bifurcación que ocurre a nivel de la nNOS podría deberse a cambios redox-dependientes de la actividad de la nNOS. Frente a un estado reducido (es decir, GSH>GSSG) se hace viable una cascada de trans-S-nitrosilación, debido a que el producto más probable de la actividad de la enzima es GSNO; en cambio en un estado más oxidado (GSH <GSSG) la vía utilizaría al NO como mensajero gaseoso. Se propone entonces un análisis de la CRF desde un punto crítico del estado redox, en la que la región de retrasos coincidiría con un estado reducido, y la de adelantos con un estado oxidado. La bifurcación entre atrasar o adelantar el reloj, ocurre en un punto crítico del estado redox neuronal, que se traduce en vías de transducción de señales diferentes, siendo la vía que se active la más favorable en el estado y lugar (e.g. localización intracelular) en el que se encuentra. Finalmente, si bien a lo largo de esta tesis se ha hecho foco en el mecanismo subyacente a la activación de la nNOS, debe comprenderse que el sistema circadiano es parte de la fisiología de los organismos. Por lo tanto, ha de comprenderse también que virtualmente toda enzima, receptor, o canal iónico, podría ser regulado tanto por el sistema redox como el circadiano, posicionando al oscilador redox como un posible sincronizador endógeno acoplado al oscilador molecular.