Nanosistemas tópicos para terapia fotodinámica de leishmaniasis cutánea : diseño y caracterización
Resumo
La leishmaniasis cutánea (LC) es una enfermedad endémica en zonas como el norte argentino, causada por parásitos del género Leishmania y transmitida por insectos flebótomos. Afecta principalmente la piel, provocando lesiones ulcerosas dolorosas y desfigurantes que requieren tratamientos prolongados con antimoniales pentavalentes, vigentes desde hace más de un siglo, los cuales presentan alta toxicidad y limitada eficacia. En este contexto, la nanotecnología ofrece soluciones innovadoras al permitir la formulación de nanosistemas capaces de superar barreras biológicas como el estrato córneo y dirigir con precisión los fármacos a las células infectadas, minimizando efectos colaterales. Entre estas estrategias, se destaca la terapia fotodinámica (TFD), que combina luz y fotosensibilizadores para generar especies reactivas de oxígeno (ERO) letales para los parásitos, con mínima toxicidad sistémica. Los puntos cuánticos de carbono (CQDs), nanopartículas fluorescentes y biocompatibles que pueden ser obtenidas a partir de residuos orgánicos, se perfilan como fotosensibilizadores eficaces por su capacidad de generar ERO y penetrar la piel a bajos costos y siendo ecológicamente amigables. Para mejorar su administración tópica, se pueden utilizar nanosistemas lipídicos como los etosomas ultradeformables, capaces de atravesar la barrera cutánea y liberar principios activos en capas profundas de la piel. En este trabajo, se desarrolló una terapia fotodinámica tópica alternativa basada en estos etosomas ultraflexibles para vehiculizar CQDs hacia células infectadas por Leishmania sp. Se formularon, caracterizaron y evaluaron estos sistemas, demostrando su potencial como alternativa innovadora, específica y no invasiva para el tratamiento de la leishmaniasis cutánea.
Para ello se sintetizaron tres tipos de puntos cuánticos de carbono a partir de espinaca (E-CQDs), té verde (TV-CQDs) y yerba mate (YM-CQDs) como fotosensibilizadores. Estos fueron caracterizados fisicoquímica y fotoquímicamente, obteniendo poblaciones mayores a 20 nm para los primeros dos y menores a 5 nm para los últimos, pudiendo tratarse de puntos cuánticos de grafeno (G-CQDs). Estos presentaron excitación en el visible y emisión en el rojo cercano, posiblemente por la presencia de residuos de clorofila superficiales. Los tres CQDs demostraron generación de ERO, pero se destacaron los E-CQDs con un rendimiento cuántico de oxígeno singlete a 350 nm cercano 30%. También se encontró una posible fotodegradación a 620 nm aproximadamente.
A nivel celular, se evaluó la actividad intrínseca y fotoactivada para las tres nanopartículas (NPs) en la línea celular de queratinocitos humanos HaCaT y en la línea celular de fibroblastos murinos 3T3, determinando las longitudes de onda y tiempos pertinentes. Los E-CQDs demostraron ser biocompatibles en condiciones sin irradiación en ambas líneas celulares, mientras que los otros dos CQDs mostraron ser más tóxicos, bajo irradiación azul (450 nm) y seguido de irradiación roja (630 nm). Este llevó a la selección de los E-CQDs como NPs fotosensibilizadoras.
En cuanto a la formulación y selección del nanosistema de entrega de activos (NEA), se evaluó el agregado de diferentes surfactantes para desarrollar etosomas ultradeformables y compararlos con los etosomas convencionales en cuanto a su tamaño, estabilidad y penetración en piel. El etosoma ultradeformable con Tween 80, de unos 120 nm aproximadamente, fue determinada como la matriz más adecuada por su estabilidad fisicoquímica, baja tendencia a la agregación y su capacidad de penetración cutánea a 1 h comparable a otras formulaciones.
Para incorporación de E-CQDs para el diseño del nanosistema final se analizó el solvente y concentración óptima de carga y cómo afecta las características fisicoquímicas evaluadas previamente. Este no solo fue compatible, sino que mejoró la estabilidad de la formulación a corto y largo plazo. Esto se observó en los diferentes métodos de encapsulación de este fotosensibilizador, seleccionándose aquél con mayor concentración encapsulada (aproximadamente 550 µg/ml, con una eficiencia de encapsulación del 31%).
Como parte de la valoración de la capacidad antileishmánica, se evaluó la captura y citotoxicidad del nanosistema (Et(E-CQDs)) en la línea celular de macrófagos murinos J774.A1, ya que la forma amastigote del parásito forma nidos intracelulares en las células inmunes. Se observó una mejor captación por parte de macrófagos al encapsular los E-CQDs, sin variaciones importantes entre los tiempos de incubación evaluados. Se estableció un tiempo de irradiación de 30 minutos como adecuado para ambas longitudes de onda. No se observó citotoxicidad en ausencia de luz, pero a las 4 h post-incubación los Et(E-CQDs) mostraron citotoxicidad concentración-dependiente más marcada que los E-CQDs libres, reduciendo la viabilidad celular cercana a 50% para irradiación roja y por debajo del 50 % para la irradiación azul.
Para los estudios sobre actividad antileishmánica, se utilizaron dos cepas: L. amazonensis y L. braziliensis, en sus dos formas: promastigote y amastigote. No se observó captura en los promastigotes, pero si porcentajes mayores al 94% de actividad antipromastigote (% APA) para los etosomas con o sin carga y un efecto significativo al irradiar a 450 nm en los E-CQDs solos y encapsulados. Aunque no se evidenciaron diferencias en el número de amastigotes intracelulares fijados tratados e irradiados, el conteo de promastigotes liberados al medio y crecidos tras 48 h permitió inferir una reducción significativa en la carga parasitaria intracelular. Un comportamiento llamativo fue observado con los E-CQDs irradiados frente a L. braziliensis, cuya eficacia disminuyó, posiblemente por desactivación o degradación del fotosensibilizador durante el periodo de incubación post-tratamiento.
En suma, los Et(E-CQDs) diseñados y caracterizados serían una plataforma alternativa para la terapia fotodinámica, en particular, de leishmaniasis cutánea. Aunque se identificaron ciertas limitaciones relacionadas con la estabilidad post-irradiación y la baja viscosidad del vehículo, son aspectos que podrán ser optimizados a futuro.