Formulaciones liposomales de activos antitumorales para la vía tópica : diseño y caracterización

Abstract

En el 2018, la incidencia del cáncer de piel no melanoma superó el millón de casos en el mundo, lo que corresponde al 5,8% de todos casos de cáncer a nivel mundial. De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud, son los cánceres de piel no melanoma –carcinoma de células escamosas (SCC) y carcinoma de células basales (BCC)– los que presentan mayor incidencia, con tasas de mortalidad semejantes a las del melanoma cutáneo. Este tipo de tumores suelen presentarse en zonas de la piel que se encuentran en constante exposición al sol, como la cara, las orejas, el cuero cabelludo y las manos, y su tratamiento consiste, en la mayoría de los casos, en la escisión quirúrgica. Por lo que no sólo se trata de tratamientos invasivos, sino que pueden dejar rastros que generan un fuerte impacto emocional en el paciente que se suma al de la propia enfermedad. Si bien existen algunos agentes quimioterapéuticos tópicos, como el 5-fluorouracilo (5-FU) e imiquimod, su uso está restringido a lesiones precancerosas, como la queratosis actínica –la cual puede progresar a SCC–, o a algunos casos puntuales de BCC y de SCC detectados precozmente, donde las lesiones son localizadas y muy superficiales. Cuando estos tumores avanzan las posibilidades de lograr un tratamiento efectivo disminuyen. Estos cánceres pueden causar destrucción local, producir deformidad grave y extenderse a zonas próximas comprometiendo órganos sensoriales. Ambos cánceres pueden generar metástasis en otras regiones del cuerpo y ser mortales. Esta tesis presenta la obtención y caracterización de dos nanoformulaciones con el potencial de poder ser utilizadas para el tratamiento de lesiones relacionadas al SCC y BCC, no solo en estadios tempranos sino también más avanzados (no metastásicos). Estas nanoformulaciones contienen, por un lado, el agente quimioterapéutico tradicional 5-FU, y por otro, la droga de última generación Vismodegib. La principal novedad es que se propone la vía tópica cutánea para la administración de ambos principios activos, mediante el transporte y entrega a estratos profundos de la piel, donde se desarrollan los BCC y SCC, con un sistema nanoestructurado. Esto permitiría en el caso del 5-FU mejorar su penetración cutánea y cambiar la ruta de administración en el caso del Vismodegib. Lo que se buscó de esta manera fue reducir los efectos secundarios relacionados a la administración sistémica, aumentar la eficacia de acción mediante tratamientos sitio-específicos, y proponer una terapia menos invasiva para el paciente. El nanosistema de delivery elegido fueron los liposomas ultradeformables (UDL), un tipo particular de nanoliposomas unilamelares capaces de atravesar el estrato córneo de la piel, la principal barrera a vencer en la administración cutánea, y transportar a las células de la epidermis viable diversos activos. Por lo tanto, se desarrollaron dos formulaciones: UDL con 5-FU (UDL-5FU) y UDL con Vismodegib (UDL-Vis), las cuales fueron caracterizadas fisicoquímicamente, mostrando en ambos casos una buena estabilidad coloidal a diferentes temperaturas (ambiente, de almacenamiento y corporal), y con una elevada eficiencia de encapsulación en el caso de los UDL-Vis. Se pudo determinar cómo es que la droga interactúa con la membrana liposomal y cómo esta interacción afectó la elasticidad de las vesículas, disminuyendo (para el caso de los UDL-5FU) o aumentando (UDL-Vis) dicha propiedad fundamental para que sean capaces de atravesar la piel. La caracterización implicó la combinación de múltiples técnicas experimentales –espectroscópicas, de fluorescencia, calorimetría– y teóricas, para poder obtener una idea acerca de cómo se estabilizan ambos sistemas. En el caso del Vismodegib, dada la poca información molecular disponible, se llevó a cabo en paralelo una caracterización química teórica de la molécula, la cual se comparó y ajustó con mediciones obtenidas por espectroscopía Raman e infrarrojo. Una vez obtenidos y caracterizados ambos nanosistemas, se estudió el perfil de penetración in vitro de los mismos en muestras de piel humana, las cuales consistieron en estrato córneo, epidermis viable y dermis. Para ello se empleó el Método de Penetración de Saarbrücken (SPM), adaptado para llevar a cabo incubaciones no oclusivas, junto con técnicas de remoción de las capas del estrato córneo, histológicas y de seccionamiento óptico mediante microscopía confocal de fluorescencia. De esta manera se pudo obtener el perfil de penetración para las dos nanoformulaciones, observando en ambos casos que fueron capaces de atravesar el estrato córneo y entregar el principio activo en la epidermis viable en el rango de concentración terapéutico. Hasta este momento, este fue el primer trabajo que estabilizó en un nanosistema de transporte de activos, específicamente diseñado para penetrar la barrera impermeable del estrato córneo de la piel, al Vismodegib, y que probó su penetración cutánea mediante el SPM. Por otro lado, se estudió la citotoxicidad in vitro de las nanoformulaciones en dos líneas celulares humanas ampliamente utilizadas para este tipo de estudios, HaCaT y SK-Mel-28, comparando los efectos con la matriz liposomal sin droga y con la droga libre, mediante tres ensayos bioquímicos diferentes. También se estudió la captura celular de los mismos y la tasa de activación de la vía de muerte celular por apoptosis. En ambos casos la encapsulación de los principios activos incrementó la citotoxicidad. Por último, se realizaron estudios de toxicidad in vivo en larvas de pez cebra (Danio rerio), un modelo de estudio intermedio entre los ensayos in vitro con células y los modelos mamíferos, cada vez más utilizado y aceptado. Para ello se llevaron a cabo diferentes tipos de determinaciones de parámetros indicadores de toxicidad y teratogénesis. En el caso de los UDL-5FU estos resultaron ser más tóxicos para las larvas que el 5-FU libre, mientras que con los UDL-Vis se observó lo contrario.