Estrategias terapéuticas para optimizar la farmacoterapia antimicótica contra la colonización/infección fúngica broncopulmonar en los pacientes con fibrosis quística

Abstract

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética autosómica, recesiva y multisistémica, que no posee un procedimiento curativo. El tratamiento interdisciplinario adecuado desde edad temprana permite reducir la morbilidad, mejorar la calidad de vida y la supervivencia de estos pacientes. Este tratamiento consiste principalmente en el control y la atenuación de los daños causados por la acumulación excesiva de mucosidad y las infecciones recurrentes, tanto a nivel pulmonar como intestinal. Además de las infecciones bacterianas, estos pacientes sufren de infecciones o colonizaciones causadas por levaduras y hongos filamentosos. Más del 90% de los pacientes con FQ son afectados por infecciones respiratorias recurrentes que desencadenan exacerbaciones de la función pulmonar, convirtiéndose en la principal causa de morbilidad y mortalidad. Entre ellos, Aspergillus fumigatus es el hongo filamentoso que con mayor frecuencia coloniza las vías respiratorias, siendo recuperado en hasta un 78% de los pacientes FQ. Además de otras especies de Aspergillus, como A. flavus, A. niger y A. terreus, los hongos filamentosos más comúnmente aislados pertenecen a los géneros Scedosporium y Exophiala. Debido a esto, los pacientes con FQ están sometidos a frecuentes ciclos de antibióticos y antifúngicos necesarios para controlar su enfermedad. El tratamiento antifúngico consiste en la administración por vía oral de fármacos de la familia de los azoles. Sin embargo, debido a la baja concentración que alcanzan estas drogas en las secreciones respiratorias excesivas presentes en los pacientes con FQ, los hongos filamentosos que colonizan/infectan sus vías respiratorias son capaces de sobrevivir a las terapias con antifúngicos y, una vez establecidos, se vuelven extremadamente difíciles de erradicar, lo que conduce a complicaciones en la sobrevida de los pacientes. Por otro lado, algunas especies fúngicas son menos susceptibles a estos fármacos. Además, la aparición en las últimas décadas de aislamientos de A. fumigatus resistentes a los triazoles es considerada un problema de salud emergente a nivel mundial, relacionado con el fracaso terapéutico y altas tasas de mortalidad en pacientes con aspergilosis invasora. En caso de resistencia, ya sea adquirida o intrínseca, se puede recurrir a la administración de otros fármacos, pertenecientes a las familias de los polienos, como la anfotericina B, o las equinocandinas. La resistencia a los azoles en A. fumigatus ha sido documentada tanto en pacientes que recibieron tratamiento antifúngico prolongado con estos fármacos, así como también en pacientes sin exposición previa a éstos (pacientes naïve). Los aislamientos recuperados de estos últimos pacientes mostraron un patrón específico de mutaciones en el promotor del gen cyp51A, el gen blanco de los azoles, y su región codificante. Esta combinación de mutaciones, denominada TR34-L98H, así como otra también la combinación TR46-T289A-Y121F, fueron encontradas en aislamientos provenientes del medioambiente. La presencia de A. fumigatus resistente a los triazoles en el ambiente se asoció al uso extensivo de antifúngicos azólicos en la agricultura. Luego, estas cepas ambientales de A. fumigatus resistentes pueden colonizar el tracto respiratorio de pacientes naïve al tratamiento con azoles. En la Argentina no existen estudios acerca de la epidemiología de las especies fúngicas que colonizan/infectan las vías respiratorias de los pacientes con FQ, ni de sus perfiles de susceptibilidad antifúngica. En base a todo esto, fue propósito de esta Tesis Doctoral profundizar en el conocimiento de la epidemiología de los hongos aislados de las secreciones respiratorias de los pacientes con FQ de Argentina mediante la tipificación de las especies y la caracterización de su perfil de susceptibilidad a los antifúngicos triazólicos y a la anfotericina B, como así también caracterizar el mecanismo subyacente de resistencia a los triazoles de uso clínico. Asimismo, se propuso desarrollar una matriz transportadora de fármacos antifúngicos eficiente, sencilla y de bajo costo, para su potencial aplicación por vía inhalatoria en el sistema pulmonar, que permita la erradicación de la colonización/infección fúngica, y así mejorar la eficacia del tratamiento antifúngico en los pacientes con FQ. Para ello, se analizó retrospectivamente una población de 223 aislamientos fúngicos provenientes de las secreciones respiratorias (esputo) de 63 pacientes con FQ atendidos en distintos centros de salud de la provincia de Buenos Aires. Estos aislamientos fueron identificados molecularmente mediante amplificación y secuenciación parcial de los genes calmodulina (cmdA) y beta-tubulina (benA). Así, se encontró que los tres géneros más frecuentemente aislados de las vías respiratorias de los pacientes con FQ fueron Aspergillus (81,6%), Scedosporium (7,2%) y Exophiala (6,3%); aunque se recuperaron aislamientos de otros géneros de forma esporádica. Luego, se procedió a evaluar in-vitro las susceptibilidades a los antifúngicos mediante la determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), siguiendo las normas establecidas por el CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute) para hongos filamentosos en el documento M38 3°ed. Los valores de CIM obtenidos fueron interpretados de acuerdo a los puntos de corte epidemiológicos (ECVs) publicados en la literatura, lo cual permitió clasificar a los hongos como salvajes o sensibles (wildtype, WT), y no salvajes o con sensibilidad disminuida (non-wildtype, non-WT). En el caso de las especies que no poseen ECVs definidos, se determinó como criterio para definir un valor alto de CIM a aquellos que fueran ≥ 8 µg/ml. De esta forma, se encontró que el 93,8% (15/16) de los aislamientos pertenecientes al género Scedosporium, el 50% (7/14) de los aislamientos identificados como E. dermatitidis, y el 7,7% (14/182) de los aislamientos pertenecientes al género Aspergillus presentaron valores de CIM > al ECV o ≥ 8 µg/ml (según corresponda), al menos a un antifúngico. Para la caracterización de los mecanismos de resistencia asociados a los aislamientos de A. fumigatus non-WT, se estudió la secuencia del promotor y región codificante del gen cyp51A. De esta forma, se observó que el 40% de los aislamientos de A. fumigatus presentaban la combinación de mutaciones TR34-L98H, mientras que en el 60% restante no se observaron alteraciones nucleotídicas en dicho gen. Es de notar que, tres de los aislamientos que poseían la mutación TR34-L98H fueron aislados secuencialmente de un único paciente con FQ, y presentaban, además, la mutación compensatoria S297T y, uno de ellos, la mutación R65K, que no había sido descripto en la literatura hasta la fecha. Esta cepa con el perfil genético TR34-R65K-L98H-S297T demostró ser aún menos sensible a los triazoles de uso clínico que las cepas con el perfil TR34-L98H-S297T. Con el fin de caracterizar el rol de esta nueva mutación en la resistencia a estos antifúngicos, se realizaron ensayos de transformación genética mediante recombinación homóloga en cepas de A. fumigatus WT y cepas knock-out para el cyp51A (hipersensible a los azoles). En base a estos ensayos, se pudo establecer que esta nueva combinación de mutaciones TR34-R65K-L98H (y no sólo R65K o TR34-R65K) es la responsable del aumento en los valores de CIM observados. Por otro lado, se evaluó la susceptibilidad a los antifúngicos de aislamientos ambientales de Aspergillus spp., recuperados de semillas procedentes de áreas agrícolas de la provincia de Buenos Aires y de Salta. Así, se encontró que el 33,3% de los aislamientos de A. flavus mostraron un fenotipo non-WT frente a los azoles de uso clínico. Para estudiar el potencial mecanismo de resistencia de estos aislamientos, se estudió la secuencia nucleotídica del gen cyp51A y sus parálogos cyp51B y cyp51C, de aislamientos WT y non-WT, donde se detectaron diversas mutaciones en todos los parálogos exceptuando el cyp51B. Por su parte, el cyp51C resultó el más polimórfico de todos, mostrando hasta 8 mutaciones distintas en las secuencias analizadas, mientras que en el cyp51A sólo se encontraron 2 mutaciones. Sin embargo, la mayoría de las mutaciones del cyp51C y todas del cyp51A fueron detectadas tanto en cepas WT como non-WT, lo cual indicaría que no son responsables (al menos no exclusivamente) de la disminución de la susceptibilidad a los triazoles. Por último, se evaluó la susceptibilidad de estos aislamientos de A. flavus frente a cuatro de los antifúngicos azólicos más frecuentemente utilizados en la agricultura (DMIs), para evaluar si existe una relación entre la disminución de la sensibilidad a estos compuestos y el fenotipo non-WT a los triazoles utilizados en la clínica. De esta forma, se realizó un estudio estadístico no paramétrico que concluyó que existiría una relación entre la disminución cruzada de la sensibilidad a los DMIs utilizados en la agricultura y los triazoles de uso clínico en A. flavus. En el trabajo de esta Tesis Doctoral se buscó desarrollar una matriz transportadora de un antifúngico triazólico, el voriconazol (VRC), para su potencial aplicación en el sistema pulmonar. Para ello, se desarrollaron micelas poliméricas (MPs) a base del polímero de injerto Soluplus® que encapsularon 5 mg/ml de VRC. Las MPs mostraron un tamaño uniforme de aproximadamente 151 nm, pudiendo ser almacenadas de forma liofilizada, y luego resuspendidas sin disminución de su actividad antifúngica. Además, demostraron ser no citotóxicas en un modelo in-vitro de células de mamífero, mantuvieron la misma actividad antifúngica que el VRC libre, y fueron capaces de liberar el fármaco de forma controlada en un medio fluido pulmonar simulado. En conclusión, en esta Tesis Doctoral se presentan los primeros estudios epidemiológicos de las infecciones fúngicas de las vías respiratorias en pacientes con FQ de Argentina, así como los perfiles de susceptibilidad a los antifúngicos. Se observaron valores elevados de CIM, entre 3,3% a 11%, para los antifúngicos azólicos, y del 9% para la anfotericina B. Además, se registró, por primera vez en nuestro país, la circulación de aislamientos de A. fumigatus non-WT para los triazoles con la mutación TR34-L98H, así como una nueva combinación de mutaciones que confieren resistencia a los azoles (TR34-R65K-L98H). Por último, las MPs desarrolladas en esta Tesis Doctoral demostraron ser capaces de encapsular y liberar de forma controlada el VRC, demostrando un gran potencial para su aplicación en la terapéutica de los pacientes con FQ.