Estudios funcionales y estructurales de un fragmento de anticuerpo inhibidor de entrada de mamarenavirus causantes de las fiebres hemorrágicas sudamericanas

Abstract

Las Fiebres Hemorrágicas Sudamericanas (FHS) son una familia de graves enfermedades infecciosas que incluyen la Fiebre Hemorrágica Argentina (FHA), Boliviana (FHB), Venezolana (FHV), Brasileña y de Chapare; y sus agentes etiológicos son los Mamarenavirus Junín (JUNV), Machupo (MACV), Guanarito (GTOV), Sabiá (SABV) y Chapare (CHAV), respectivamente. Debido a su alta infectividad y mortalidad, y su capacidad de propagarse de persona a persona constituyen una seria amenaza, por lo que son clasificados como agentes patógenos de Categoría A por el NIAID de los EE.UU. En la actualidad, existe vacuna solo contra la FHA (CANDID#1) y de todas las FHS, la única que tiene tratamiento eficaz es la FHA. Este tratamiento consiste en la inmunoterapia pasiva utilizando el plasma de pacientes convalecientes. Sin embargo, este tratamiento no muestra eficacia en pacientes con más de 8 días de evolución y plantea el riesgo de enfermedades transmitidas por transfusión. El objetivo general de esta tesis es avanzar en el desarrollo de un agente inhibidor de entrada de virus como potencial tratamiento para las FHS. Debido a la peligrosidad de este grupo de enfermedades se han desarrollado modelos in vitro no patogénicos que mantienen algunas de sus propiedades y que permitan su manipulación en condiciones estándar de laboratorio con una mayor seguridad para el operador. En este trabajo se validó un modelo in vitro de pseudovirus utilizando plasma de pacientes convalecientes de FHA y pseudovirus decorados con el complejo GP1/GP2 de JUNV. Aquí se determinó una protección de más del 90% hasta diluciones 1:2.000 con el plasma de pacientes convalecientes de FHA de alto título. Luego, utilizando la misma estrategia pero con el complejo GP1/GP2 de MACV, CHAV, GTOV y SABV, se estudió la posible reactividad cruzada del plasma de pacientes convalecientes de FHA. En contraste con lo observado con JUNV, solo se obtuvo una disminución significativa de la internalización de pseudovirus de MACV y GTOV en presencia de la mayor concentración de plasma evaluada. Mientras que para SABV y CHAV no se observó respuesta significativa en las diluciones ensayadas. Esto sugiere que el tratamiento con plasma de pacientes convalecientes de FHA no beneficiaría a las personas infectadas con las otras FHS. Previamente hemos demostrado que el anticuerpo monoclonal ch128.1 contra hTfR1 tiene actividad polivalente, ya que es capaz de bloquear en más de 90% la internalización de pseudovirus de JUNV, MACV, CHAV, GTOV y SABV. Sin embargo, ch128.1 tiene isotipo IgG3 humano, y un inhibidor de entrada de virus dirigido a un target ubicuo como hTfR1 con este isotipo induciría una potente actividad efectora del sistema inmune que pueden dañar a células sanas que expresan hTfR1. Por lo tanto, se realizaron anticuerpos recombinantes con la región variable del anticuerpo ch128.1, de forma completa o como cadena simple de regiones variables (scFv) con el fin de obtener proteínas sin actividad efectora y que mantengan la especificad contra el hTfR1. Debido a que no fue posible producir con alto rendimiento y pureza un scFv, se realizó el tratamiento con papaína del anticuerpo ch128.1 con IgG1 y se purificaron los fragmentos Fab (Fab128.1). Se evaluó la capacidad de esta molécula monovalente de unirse a hTfR1 y también de bloquear la internalización de pseudovirus de todas las FHS. Se observó que, al igual que el anticuerpo bivalente ch128.1, el fragmento monovalente Fab128.1 fue capaz de bloquear la entrada de todos los Mamarenavirus patógenos. Por lo tanto, sería factible producir una molécula monovalente del anticuerpo ch128.1 como una terapia dirigida para las FHS, sin actividad efectora y a un menor costo de producción comparado con un anticuerpo completo. La determinación de la base estructural de la especificidad anticuerpo-antígeno es crucial para comprender el mecanismo de reconocimiento inmune y el diseño racional de biofármacos. Por lo tanto, se resolvió la estructura atómica de las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs) del anticuerpo ch128.1 por cristalografía de rayos X del Fab128.1 y luego se utilizó la estructura resuelta y herramientas bioinformáticas, para modelar la interacción del anticuerpo con el hTfR1 in silico. De esa forma se propone un mecanismo molecular que explicaría el efecto sobre el boqueo de la internalización de pseudovirus de las FHS. Este mecanismo consistiría en una competencia por el sitio de unión del anticuerpo ch128.1 y las GP1 virales sobre el hTfR1, producto del solapamiento de 11 residuos. Estos estudios de estructura-función proveen evidencia que permitirían establecer los mecanismos moleculares responsables de la actividad de un anticuerpo inhibidor de entrada de virus y contribuirán al diseño racional de nuevos biofármacos dirigidos hacia el hTfR1 como una estrategia novedosa que contribuya al tratamiento de todas las FHS.