Regulación genética y epigenética de la producción de IFN-γ y su asociación con la susceptibilidad a la tuberculosis

Abstract

La tuberculosis, causada por el patógeno Mycobacterium tuberculosis, a pesar de ser una enfermedad curable, continúa siendo un grave problema para la salud mundial causando altos niveles de morbilidad y mortalidad. Comprender el rol de los factores genéticos en el control de la resistencia/susceptibilidad a la tuberculosis abriría posibilidades de desarrollar medidas preventivas y terapias genotípicas-específicas, optimizando la respuesta inmune frente a M. tuberculosis. Los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) son la “marca genética de susceptibilidad” elegida en estudios de caso-control. Teniendo en cuenta la importancia del IFN-y en la respuesta inmune frente a M. tuberculosis, en el presente trabajo de tesis evaluamos el SNP +874 A/T del IFNG. Previamente reportamos que la Molécula linfocitaria activadora de señales (SLAM), induce la producción de IFN- y en respuesta a la infección por M. tuberculosis, regulando la respuesta Th1 protectiva. Teniendo en cuenta estos antecedentes analizamos los SNPs -262 A/T, -188 A/G y +1343 G/T de SLAM. Por otro lado, dado que la proteína de unión a SLAM (SAP) es un regulador negativo de la producción de IFN- y inducida por SLAM, se evaluaron tres SNPs presentes en este gen (-631 A/G, -494 A/G y -346 C/T). De los siete SNPs estudiados, el SNP +874 A/T es el único previamente reportado en estudios de susceptibilidad a la tuberculosis en varias poblaciones alrededor del mundo. Nuestros resultados demostraron elevada frecuencia del genotipo AA del SNP de IFN- y +874 A/T en el grupo de pacientes con tuberculosis activa, sin embargo no se observó asociación con los niveles de producción de esta citoquina. Así el alelo A y el genotipo AA del SNP +874A/T del IFN- y podría ser considerado un marcador de susceptibilidad a la tuberculosis en nuestra población de estudio. Sin embargo este marcador no estaría asociado con la severidad de la enfermedad. En cuanto a los tres SNPs de SLAM analizados, hallamos elevada frecuencia del haplotipo AA/GG de los SNPs de SLAM -262 A/T y -188 A/G y del genotipo GG del SNP de SLAM +1343 G/T en los tres grupos en estudio (pacientes con tuberculosis activa, individuos con tuberculosis latentes y dadores sanos). Debido a esto, los SNPs de SLAM evaluados no pueden ser considerados una marca genética de riesgo para el desarrollo de tuberculosis activa. Finalmente, al estudiar los SNPs de SAP observamos que los genotipos AA (SNP -631 A/G), GG (SNP -494 A/G) y TT (SNP -346 C/T) de manera individual y de acuerdo a lo esperado, como haplotipo AA/GG/TT, podrían ser marcadores de susceptibilidad para el desarrollo de la tuberculosis, dada su alta frecuencia en el grupo de pacientes con tuberculosis activa. Más aún, estos SNPs se asocian con a una menor producción de IFN- y. En pacientes con tuberculosis activa el alelo T del SNP de SAP -346 C/T se asocia con mayores niveles de ARNm de SAP y menor producción de IFN- y, lo cual podría deberse a que la citosina presente en esta posición es un sitio de metilación (por lo que la presencia del alelo T impide la misma). Interesantemente, hallamos que la combinación haplotípica IFN- y-SAP AA-AA/GG/TT además podría ser considerado un marcador genético de riesgo a la progresión a la tuberculosis activa. Por otro lado, ha sido sugerido que la variación pre-existente en el epigenoma de poblaciones celulares específicas puede afectar la susceptibilidad del hospedador a la tuberculosis. La metilación del ADN y la acetilación de histonas son los mecanismos de regulación epigenética más ampliamente estudiados. En el presente trabajo decidimos evaluar el estado de metilación del sitio CpG -53 presente en la región promotora del gen de IFN- y. Este sitio ha sido demostrado por tener un fuerte impacto en el control de la expresión de IFNG cuando fue analizado en líneas celulares Th1. Observamos elevada metilación del sitio CpG -53 en muestras de sangre de pacientes con tuberculosis activa, lo que sugiere una falla en la regulación epigenética de este sitio el cual debería demetilarse durante la enfermedad activa, permitiendo la diferenciación eficiente hacia un perfil Th1. Blimp1 y TLE4 forman un complejo represor capaz de inhibir la expresión del gen de IFN- y en células Th2 y en condiciones de anergia. Interesantemente, observamos que tanto en pacientes con tuberculosis activa como en dadores sanos, la cinética de expresión de los represores se asocia de manera inversa con respecto al IFN- y. Es decir, los mayores niveles de expresión de IFN- y se observaron en aquellos tiempos donde se detectaron los niveles más bajos de ambos represores Blimp1 y TLE4. Así, estos resultados sugerirían un rol represor de Blimp1 y TLE4 en el control de la expresión de IFN- y en respuesta a la estimulación con M. tuberculosis. El mecanismo de represión del complejo Blimp1/TLE4 es el reclutamiento de deacetilasas de histonas (HDACs) del tipo I/II, metiltransaferasas de ADN e histonas metiltransferasas al locus IFNG. Al utilizar el inhibidor de deacetilasas benzamida (MS-275) específico de HDACs del tipo I, la producción de IFN- y se incrementó significativamente. Así, estos resultados demuestran que la deacetilación de las histonas es uno de los mecanismos de regulación negativa de la producción de IFN- y en respuesta a M. tuberculosis, sugiriendo además que el complejo Blimp1/TLE4 podría estar involucrado en el control epigenético del IFN- y en respuesta a la infección por M. tuberculosis, a través del reclutamiento de HDACs a la cromatina. En conjunto los resultados obtenidos permiten establecer una marca genética de susceptibilidad a la tuberculosis y aportan nuevos mecanismos de regulación genética y epigenética de la producción de IFN- y en la respuesta inmune frente a M. tuberculosis.

Tuberculosis, an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, despite being a curable disease, is still a global health problem that causes high mortality and morbidity rates. Understanding the genetic factors that determine resistance/susceptibility to tuberculosis would open new opportunities for the development of preventive measures and specific genotypic therapies, improving the immune response against M. tuberculosis. Single Nucleotides Polymorphisms (SNP) are the susceptibility genetic mark of choice in case control studies. IFN-y is a key cytokine in the immune response against M. tuberculosis. Therefore, in this work we evaluated the +874 A/T SNP of IFNG. Moreover, we have previously shown that the Signaling Lymphocytic Activation Molecule (SLAM) induce IFN-y production in response to M. tuberculosis, regulating the generation of Th1 protective responses. Taking this in consideration, we analyzed the -262 A/T, -188 A/G and +1343 G/T SLAM SNPs. Moreover, since SLAM associated protein (SAP) is a negative regulator of SLAM induced- IFN-y, three SNPs on this gene were also evaluated (-631 A/G, -494 A/G y -346 C/T). The +874 A/T SNP of IFN-y is the only one of the seven SNPs studied, that has been previously evaluated for tuberculosis susceptibility in other populations around the world. Our results demonstrate an elevated frequency of the AA genotype of the IFN-y +874 A/T SNP in the group of patients with active tuberculosis, however no association was observed with the levels of cytokine produced in response to M. tuberculosis. Thus, the Abstract -6- AA genotype of IFN-y +874A/T SNP could be a susceptibility marker of tuberculosis in Argentina. However, this marker was not associated with disease severity. Regarding SLAM SNPs, we found an elevated frequency of the AA/GG haplotype for the SLAM -262 A/T and -188 A/G SNP; and the GG genotype of SLAM +1343 G/T SNP in the three groups of individual evaluated (patients with active tuberculosis, individuals with latent tuberculosis infection and healthy donors). Therefore, the SLAM SNPs studied could not be considered as genetic markers for tuberculosis susceptibility. Finally, for the SAP SNPs we observed that the AA (SNP -631 A/G), GG (SNP -494 A/G) and TT (SNP -346 C/T) genotypes individually and as an haplotype (AA/GG/TT), could be a strong marker of tuberculosis susceptibility, since the high frequency found in patients with active tuberculosis. Moreover, those SNPs were associated with lower IFN-y production. Patients with the T allele for the SAP -346 C/T SNP showed the highest levels of SAP mRNA and the lowest production of IFN-y, which could be a consequence of a differential epigenetic regulation of the gene (since the cytosine in this position is plausible of being methylated). Interestingly, we found that the SAP haplotype in combination with the AA susceptible genotype of IFN-y (IFN-y-SAP AA AA/GG/TT) could also be a genetic marker of risk for disease progression. On the other hand, it has been suggested that pre-existing variations in the epigenome of specific cell populations could mediate host susceptibility to tuberculosis. DNA methylation and acetylation of histones are the epigenetic mechanisms more widely studied. In this work we evaluated methylation at the -53 CpG site of the promoter region of IFN-y. This site has a strong impact in the control of IFNG expression in Th1 cell lines. We observed and increased methylation of the -53 CpG site in blood samples of tuberculosis patients, which suggest a failure on the epigenetic regulation during Abstract -7- active disease, since demethylation of this site would occur to allow and efficient Th1 differentiation. Blimp1 and TLE4 binds to form a repressor complex that is capable of inhibits IFN-y gene expression in Th2 cells and during anergic conditions. Interestingly, we observed that M. tuberculosis stimulated cells from patients with active tuberculosis and healthy donors positively regulated these two repressors and that it’s kinetic of expression was negatively associated with IFN-y mRNA expression. Meaning, the highest levels for IFN- y were observed at those times were low levels of Blimp1 and TLE4 were detected. Thus, these results suggest that Blimp1 and TLE4 could have a role in the control of IFN-y expression in response to M. tuberculosis stimulation. The mechanism of repression mediated for the Blimp1/TLE4 complex involves the recruitment of type I/II histone deacetylases (HDACs), DNA methyltransferases and histone methyltransferases at the IFNG locus. By using an HDAC inhibitor (MS-275), which specifically inhibits type I HDACs, we observed a significantly increase of IFN-y in M. tuberculosis stimulated cells. Therefore, this results demonstrate that histone deacetylation is one of the mechanisms that negatively regulate IFN-y production in response to M. tuberculosis, suggesting that the Blimp1/TLE4 repressor complex could be involved in the epigenetic control of IFN-y during M. tuberculosis infection, through the recruitment of HDACs to the chromatin. Taken together our results allow the identification of a genetic mark of tuberculosis susceptibility and contribute with new mechanisms of genetic and epigenetic regulation of IFN-y in the immune response against M. tuberculosis.