Nuevos péptidos antimicrobianos como estrategia frente al problema de la resistencia a los antibióticos, evaluación in vitro e in vivo. Análisis de un mecanismo de protección mediado por NDM-1 en Galleria mellonella

Abstract

En este trabajo de doctorado se realizó la caracterización y evaluación, tanto in vitro como in vivo, de una serie de nuevos péptidos antimicrobianos (PAMs). A partir de tres secuencias diseñadas y evaluadas previamente en el laboratorio, se realizaron modificaciones aminoacídicas específicas y se obtuvieron seis secuencias nuevas. Con estas nuevas secuencias, y al compararlas con sus secuencias parentales, se pudieron obtener datos valiosos sobre la influencia de los diferentes parámetros fisicoquímicos y la interacción de estos PAMs con membranas biológicas. En estos estudios se realizó la caracterización de todas las secuencias analizando parámetros fisicoquímicos in silico y también de forma experimental mediante ensayos biofísicos de estructura secundaria e interacción con membranas modelo y eritrocitos. Los resultados obtenidos permitieron hipotetizar un posible mecanismo de acción sobre las membranas bacterianas y echar luz sobre la influencia de algunos parámetros fisicoquímicos en la selectividad de los PAMs por membranas procariotas o eucariotas. Posteriormente se analizó la actividad biológica in vitro, evaluando toxicidad sobre eritrocitos murinos y actividad antimicrobiana y antibiofilm en Staphylococcus aureus ATCC25923 y Pseudomonas aeruginosa PAO1. Los péptidos con mejor actividad y menor toxicidad fueron seleccionados para trabajar con un aislamiento clínico que presenta resistencia a carbapenemes: P. aeruginosa M13513. En esta cepa se evaluó la actividad antimicrobiana, antibiofilm y la sinergia de los péptidos con meropenem. La mayoría de los PAMs presentaron buena actividad antibacteriana tanto en las cepas sensibles como en la resistente a carbapenemes, y tres de ellos mostraron efecto sinérgico con meropenem. Posteriormente, se puso a punto un modelo de infección en larvas de Galleria mellonella (GM), para las tres cepas bacterianas utilizadas. En este modelo se evaluó actividad antimicrobiana in vivo de los péptidos seleccionados frente a todas las cepas, así como el efecto sinérgico con meropenem frente al aislamiento clínico. Finalmente, se utilizó el modelo de infección en GM enfocado en el estudio de metalo-β-lactamasas. En esta parte del trabajo se decidió evaluar in vivo si la presencia de metalo-β- lactamasa Nueva Delhi (NDM-1) secretada en vesículas de membrana externa (OMVs, por sus siglas en inglés) es capaz de brindar protección en infecciones con Escherichia coli sensible a carbapenemes, y en co-infecciones de E. coli que secreta OMVs con NDM-1 y P. aeruginosa sensible. Los resultados obtenidos permitieron comprobar que la secreción de NDM-1 anclada a OMVs es capaz proteger poblaciones bacterianas circundantes durante co-infecciones en GM.