Estudio fisicoquímico de modelos de plegado complejos: el caso del dominio PDZ de la proteína β2–Sintrofina

Abstract

La proteína β2-sintrofina es una proteína citoplasmática de las llamadas ‘proteínas de andamiaje’, que juega un rol primordial en la regulación de la secreción de insulina gracias a su interacción con la proteína de membrana ICA512, la cual se encuentra en la membrana de los gránulos de secreción de insulina (GSI), en las células β del páncreas. La interacción entre β2-sintrofina e ICA512 ancla los GSI al cito esqueleto de actina. El estado de fosforilación de β2-sintrofina regula esta interacción, y la disrupción del complejo permite la exocitosis de los gránulos. En esta interacción participa el dominio PDZ de β2-sintrofina (β2S–PDZ). Hemos estudiado el desplegado térmico de β2S–PDZ en el equilibrio con diferentes técnicas biofísicas. Los termogramas obtenidos mediante dicroísmo circular (CD) en el UV-lejano en distintas concentraciones de urea, y por calorimetría diferencial de barrido (DSC) muestran transiciones anchas y desnaturalización por frío. Las transiciones probaron ser reversibles con ambas técnicas. Los termogramas de CD seguidos a diferentes longitudes de onda no son superponibles, y las temperaturas media de la transición (Tm) y de máxima estabilidad (Tmax) muestran una dependencia con la concentración de urea. Los termogramas de DSC permiten descartar la formación de dímeros u otros oligómeros. A diferencia de la mayoría de los dominios PDZ estudiados, la desnaturalización térmica de β2S–PDZ en condiciones de equilibrio no es descripta satisfactoriamente por modelos de estados discretos, como los modelos de dos o de tres estados. Esto plantea la posibilidad de que el proceso de plegado involucre a un estado de transición correspondiente a una barrera energética muy baja o que la proteína siga un modelo de estado único (modelo ‘cuesta abajo’ o ‘downhill’). Según este modelo, la proteína se encuentra en un único estado a lo largo del experimento de desnaturalización térmica, pero el ensamble conformacional de ese estado varía con la temperatura. De esta manera, en estas proteínas se observa que distintos elementos de estructura secundaria se despliegan de manera cuasi independiente, o sin cooperatividad. Nuestros estudios de desnaturalización térmica seguida por CD y por DSC indican que el comportamiento de β2S–PDZ es mejor descripto por un modelo de tipo continuo. La mayor estabilidad de β2S–PDZ a pH alcalino, y el análisis computacional de la estructura tridimensional indican que el comportamiento de plegado de β2S–PDZ puede estar relacionado con su distribución de residuos cargados. Estudiamos además el comportamiento de residuos individuales en distintas condiciones de temperatura, entre 5 y 50 ◦C, por resonancia magnética nuclear (RMN). Los valores de los experimentos de dinámica T1, T2 y NOE heteronuclear indican que a bajas temperaturas β2S–PDZ se encuentra en una estructura relativamente rígida, con excepción de la hélice αA que presenta movimientos conformacionales lentos. Si bien no hemos podido realizar una curva de desnaturalizaci´on hasta altas tempera- turas por limitaciones técnicas, hemos podido alcanzar valores correspondientes a la Tm de experimentos de CD y DSC. Así, de nuestros resultados pudimos extraer información importante acerca de los eventos tempranos del proceso de desnaturalización térmica de β2S–PDZ, los cuales corresponderían a una etapa de cambio gradual en la estructura. Nuestros resultados indican que β2S–PDZ sufre cambios conformacionales graduales dependientes de la temperatura, que indicarían la aplicabilidad de los modelos de desplegado continuo. Además, este comportamiento podría tener relevancia en la regulación de la secreción de insulina, en concordancia con la hipótesis de que pequeñas proteínas con un comportamiento de plegado continuo podrían funcionar en la célula como ‘reostatos moleculares’.