Participación de la glicosilación aberrante en glioma y neuroblastoma

Abstract

Los glicanos son considerados una de las cuatro macromoléculas esenciales para la vida celular. La glicosilación es un mecanismo enzimático finamente regulado que afecta a una gran cantidad de proteínas y lípidos, y que participa tanto estructural como funcionalmente en la biología celular. Dentro de los glicoconjugados, las glicoproteínas poseen principalmente modificaciones postraduccionales con N- y O-glicanos, definidos por su enlace covalente a la Asparragina o Serina/Treonina del polipéptido, respectivamente. La investigación en glicobiología no deja de poner en evidencia la importancia de los glicanos en la gran mayoría de los procesos celulares. En este sentido, en el fenómeno de transformación maligna, la participación de los glicanos ocupa un papel protagónico. En las células tumorales se expresa un perfil de glicosilación con características particulares conocido como glicosilación aberrante que, en gran medida, modula la interacción de la célula tumoral con su entorno. Las alteraciones que ocurren con mayor frecuencia están asociadas a los procesos de sialilación, fucosilación, aparición de glicanos de la familia Lewis, síntesis de glicanos truncados y alteraciones en las ramificaciones tanto en N- como en O-glicanos. Si bien la glicosilación aberrante es un actor importante en la biología tumoral, su conocimiento proviene principalmente del estudio de indicaciones como carcinomas de adultos y poco se sabe sobre su papel en canceres de origen del sistema nervioso como el neuroblastoma (NB) y el glioma. Por lo tanto, este trabajo trata sobre la caracterización de la glicosilación aberrante en estas indicaciones y su participación en la biología de la célula tumoral. Principalmente se caracterizó la expresión de O-glicanos truncados y de la familia Lewis, así como la expresión de las glicosiltransferasas involucradas en su síntesis, sus implicancias en diferentes capacidades celulares, y se estudio de manera preliminar la regulación de su expresión mediada por mecanismos epigenéticos. Además, se profundizo el estudio en glioma haciendo foco en dos glicoproteínas estrechamente vinculadas con la malignidad y que son blanco de diferentes estrategias terapéuticas en la actualidad, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la integrina αv (Iαv). El NB es la neoplasia maligna pediátrica más común diagnosticada antes del primer año, en la que la amplificación del oncogen MYCN se asocia con un mal pronóstico y es el principal criterio clínico para estratificación en alto riesgo. En este trabajo se utilizaron líneas celulares humanas y material histológico de pacientes con diferente estatus de amplificación de MYCN. Los resultados muestran alta expresión de glicanos de la familia Lewis en líneas celulares con amplificación de MYCN. Los resultados indicaron que estos glicanos en NB se asientan prioritariamente en anclajes de tipo O. Tanto las líneas celulares como las muestras de pacientes con amplificación de MYCN mostraron sobreexpresión de la glicosiltransferasa iniciadora de las estructuras del core 2 de los O-glicanos, C2GNT1, así como de sialil- y fucosiltransferasas necesarias para la síntesis de los Lewis, en comparación con sus contrapartes sin amplificación del oncogen. El tratamiento con el inhibidor de N-glicanos tunicamicina (TNM) no produjo cambios en la expresión de los Lewis en las células de NB. Por el contrario, el silenciamiento de C2GNT1 disminuyo la expresión de los Lewis, la unión a E- y P-selectina, así como también redujo la adhesión, la migración y la proliferación celular in vitro. Por otro lado, el tratamiento de las células sin amplificación de MYCN con el inhibidor de amplio espectro de deacetilasas de histonas (HDAC) conocido como tricostatina A (TSA), aumento la expresión de glicanos Lewis, la unión a E-selectina y la expresión de glicosiltransferasas de su vía de síntesis. Estos resultados contribuyen a la hipótesis de que las células de NB con amplificación de MYCN sobreexpresan los glicanos de la familia Lewis, anclados principalmente a estructuras del core 2 O-glicanos, y que su expresión juega un papel clave en el comportamiento maligno de las células NB, que además esta modulada por mecanismos epigenéticos. Los gliomas son un grupo de tumores del sistema nervioso central derivados de la glia, siendo los tumores primarios intracraneales más comunes. Para este trabajo se utilizaron diez líneas celulares de glioma humano de alto y bajo grado. Los resultados muestran alta expresión de glicanos Lewis, principalmente SLex, y sobreexpresión de sialil- y fucosiltransferasas en las líneas de glioma de alto grado. Se caracterizaron estructuras de ramificación de glicanos, donde se observó una asociación de N-glicanos complejos tri- y/o tetra-antenarios con ramificaciones β1-6GlcNAc en las líneas de alto grado y sobreexpresión de los niveles de transcripto del gen MGAT5, que codifica la enzima que sintetiza estas ramificaciones. No se observaron diferencias en los niveles de expresión de los transcriptos de C2GNT1 entre las líneas celulares, así como tampoco cambios en la adhesión o migración tras su silenciamiento. La regulación negativa de la N-glicosilación mediante la incubación con los inhibidores TNM y swainsonina (SW), o el silenciamiento de MGAT5 produjeron una reducción en la expresión de SLex, así como la disminución en las capacidades de adhesión y migración en glioma de alto grado. Sin embargo, no se observaron cambios significativos en estas capacidades celulares en células de bajo grado luego de estos tratamientos. La inhibición de HDAC con TSA provoco un aumento en la expresión de los Lewis en células de glioma de bajo grado. Estos resultados contribuyen a la hipótesis de que las células de glioma de alto grado presentan alta expresión de los glicanos de la familia Lewis, anclados principalmente a N-glicanos complejos, que su expresión juega un papel clave en el comportamiento maligno de las células tumorales, y que su expresión estaría parcialmente modulada por mecanismos epigenéticos. Se continuó con el estudio de la glicosilación de las proteínas asociadas al glioma, EGFR e Iαv. Los resultados obtenidos de la caracterización indirecta sobre células de alto grado mediante inmunoprecipitación y Western Blot mostraron el reconocimiento de Lex y glicanos complejos tri-/tetra-antenarios con ramificaciones β1-6 GlcNAc en EGFR, así como glicanos de tipo oligomanosa y /o complejos bi-antenarios en Iαv. Se estudio la respuesta a EGF en glioma de alto y bajo grado tras la regulación negativa de la Nglicosilación. En ambas líneas celulares se evidencio una inhibición de la reorganización del citoesqueleto de actina bajo el estímulo con EGF, sugiriendo un rol importante de los N-glicanos en la interacción de EGFR con su ligando y/o con su par dimerico. La caracterización de la glicosilación de Iαv mediante espectrometría de masas permitió describir seis sitios de glicosilación en células de alto grado (Asn74, Asn554, Asn615, Asn875 y Asn945) y dos en las de bajo grado (Asn74 y Asn875). En glioma de alto grado se observaron eventos de microheterogeneidad con glicanos pertenecientes a diferentes familias estructurales en cuatro de los seis sitios estudiados. En general se observó una mayor abundancia de N-glicanos de tipo complejo/hibrido, aunque también se detectaron N-glicanos del tipo oligomanosa. En la Iαv de células de glioma de bajo grado solo se encontraron N-glicanos de tipo oligomanosa. La participación de los glicanos en el contexto tumoral pone de manifiesto la importancia de estas moléculas en la biología tumoral. El estudio de la glicosilación aberrante en cáncer emerge como un nicho de biomarcadores y blancos terapéuticos novedosos que pueden ser de interés para el desarrollo de terapias dirigidas. Los resultados de este trabajo aportan valiosa información al conocimiento de la glicobiología sobre el glioma y el NB, explorando la participación de los glicanos en la biología tumoral.