Desarrollo y evaluación de formulaciones vacunales a partir de miméticos de carbohidratos tumorales para el tratamiento del cáncer

Abstract

La glicosilación aberrante es un fenómeno altamente descripto en la transformación maligna y la progresión tumoral. Las alteraciones en el patrón de glicosilación pueden adquirir una variedad de formas: la pérdida o excesiva expresión de ciertos glicanos, la expresión aumentada de glicanos incompletos o truncados y, menos frecuentemente, la aparición de glicanos novedosos. Dentro de los glicanos relevantes en cáncer podemos mencionar a la glicoproteína PSGL-1, la cual se encuentra sobreexpresada en varios tipos de tumores. Esta expresión se encuentra asociada a progresión tumoral, metástasis y regulación inmune. Algunos glicanos de la familia Lewis, Sialyl Lewis X, Lewis X y Lewis A se encuentran sobreexpresados en distintos tipos de cáncer, donde se los ha asociado a metástasis a una pobre sobrevida en pacientes. El glicano truncado STn se encuentra expresados en el más del 80% de todos los carcinomas humanos, donde su presencia se asocia con la progresión tumoral, metástasis y mal pronóstico en pacientes. STn ha sido blanco de desarrollo de terapias ya que no se suele encontrar en tejidos adultos sanos. El glicolípido GD2 se encuentra sobreexpresado en varios tipos de cáncer embrional como neuroblastoma, tumores de cerebro, retinoblastoma, entre otros. Este gangliósido GD2 está involucrado en crecimiento celular, proliferación, invasión y apoptosis. Teniendo en cuenta que estos glicanos se encuentran expresados de manera diferencial en las células tumorales en comparación con los tejidos sanos y que están implicados en funciones biológicas relacionadas con la progresión tumoral, estos antígenos son buenos blancos para el desarrollo de terapias. Dentro de las terapias antitumorales, las inmunoterapias han ido adquiriendo relevancia en los últimos años. Dentro de este grupo de terapias se encuentran las vacunas antitumorales. Estas buscan activar y dirigir al sistema inmune contra un blanco o antígeno específico en el tumor; suelen tener baja toxicidad y son fáciles de administrar. El desarrollo de vacunas antitumorales basadas en carbohidratos ha avanzado en los últimos años y varias han logrado, escalar hasta ensayos clínicos en humanos. Sin embargo, no hay ninguna terapia de este tipo aprobada para su uso comercial. Este tipo de vacunas debe superar ciertas dificultades para poder lograr activar mecanismos citotóxicos y poder tener una efectiva respuesta inmune antitumoral. Los carbohidratos son antígenos independientes de células T, por lo cual son frecuentemente pobres inmunógenos. En general, estos antígenos generan una respuesta inmune IgM débil, inadecuada para generar citotoxicidad antitumoral. Por otro lado la producción a gran escala de carbohidratos sigue siendo un proceso complejo. Existe, sin embargo, otra estrategia para desarrollar vacunas antitumorales dirigidas a glicanos presentes en el tumor que podría superar estas dificultades: la de utilizar péptidos que mimeticen carbohidratos o partes de ellos. Los péptidos pueden generar respuestas inmunes fuertes y pueden ser amplificados con técnicas de ingeniería genética en grandes cantidades o simplemente sintetizados de manera química. Además estos péptidos son seguros, estables y pueden ser fusionados a distintos carriers para aumentar su inmunogenicidad. Un método que se ha aplicado para seleccionar este tipo de péptidos es la utilización de bibliotecas de fagos que expresan en su superficie millones de péptidos con combinaciones al azar de aminoácidos. Al desafiar esta biblioteca contra anticuerpos específicos para el glicano de interés se seleccionarán péptidos que mimeticen el carbohidrato. Este tipo de mimética se denomina antigénica. Se espera que estos péptidos puedan actuar como vacunas antitumorales, generando una respuesta inmune con reactividad cruzada hacia el glicano de interés, fenómeno que se denomina “mimética inmunológica”. El objetivo de este trabajo fue desarrollar formulaciones vacunales basadas en péptidos miméticos de glicanos relevantes en cáncer, tales como PSGL-1, SLeX, LeX, LeA, STn y GD2. Para ello se seleccionaron péptidos miméticos utilizando una biblioteca de fagos y anticuerpos monoclonales específicos para los glicanos. Posteriormente, se fusionaron las secuencias de los péptidos al carrier bacteriano BLS (Brucella Lumazina sintetasa). Las quimeras de BLS resultantes exponen 10 copias del péptido y resultan altamente inmunogénicas. Por último se evaluaron distintos esquemas de inmunización con las quimeras de BLS en modelos murinos, de modo de analizar si la respuesta inmune generada tenía reactividad cruzada con los glicanos de interés. Se lograron identificar péptidos capaces de ser reconocidos por el Ac anti-GD2, el Ac anti-SLeX, el Ac anti-PSGL-1 y el Ac anti-LeA. De esta primera serie de péptidos se logró seleccionar 4 candidatos para GD2, 2 para SLeX, 4 para PSGL-1 y 7 para LeA que lograron demostrar, en mayor o menor medida, tener mimética antigénica con los glicanos. Las secuencias de los candidatos GdC y SxA fueron fusionadas a la proteína carrier BLS generándose dos proteínas quiméricas. La quimera GdC logró ser expresada y purificada, corroborándose su mimética antigénica con el gangliósido GD2. La quimera SxA logró ser expresada y se obtuvieron dos formulaciones de la misma: la quimera agregada por un lado y la quimera en 4M urea por el otro, ambas en buffer PBS. Esta quimera sólo mantuvo su mimética antigénica con el carbohidrato SLeX, en condiciones desnaturalizantes. Por último, se evaluó la capacidad de la quimera GdC y de las dos formulaciones de la quimera SxA de generar una respuesta inmune con reactividad cruzada hacia los glicanos de interés. Para ello se ensayaron dos protocolos distintos de inmunización en tres cepas de ratones con distinto haplotipo de MHC: C57, BALB/c y CF1. En el caso de la quimera GdC, sólo se pudo detectar respuesta contra GD2 en el suero de un ratón C57 utilizando el protocolo 1 de inmunización, mediante ELISA contra el gangliósido puro y mediante citometría de flujo contra una línea celular positiva para GD2. Sin embargo este resultado no se pudo replicarse en otros ensayos de inmunización. Por otro lado, con respecto a la quimera SxA, sólo los sueros de dos ratones de la cepa CF1 lograron reconocer una línea celular tumoral positiva para SLeX utilizando la quimera agregada y el protocolo 1 de inmunización. El fenómeno de mimética inmunológica es muy complejo y se han reportado varios casos como el nuestro, en donde péptidos que mostraron mimética antigénica, fallan a la hora de generar respuestas inmunes fuertes con reactividad cruzada hacia el glicano de interés. Esta es la primera vez que se utiliza este diseño experimental para el desarrollo de inmunoterapias antitumorales basadas en péptidos miméticos de glicanos en nuestro país. Aunque las inmunizaciones no hayan arrojado resultados satisfactorios concluyentes, esta experiencia sirvió para comprender mejor estos procesos de manera de optimizar, en el futuro, estrategias terapéuticas similares.