Dinámica de cavidades proteicas : flexibilidad y cambios conformacionales

Abstract

La flexibilidad y dinámica de proteínas pueden considerarse como el puente que permite conectar su estructura y función biológica. Actualmente está bien establecido que la formafuncional de una proteína, normalmente conocida como el estado nativo, no puede ser representada por una única estructura. El estado nativo de una proteína se define como una distribución no uniforme de poblaciones de confórmeros en equilibrio dinámico. El paisaje energético de proteínas puede describirse como un equilibrio de poblaciones preexistentes, de estados separados por barreras energéticas que pueden superarse mediante fluctuaciones térmicas. Estos estados corresponden a diferentes conformaciones cuyas poblaciones siguen distribuciones de acuerdo con la termodinámica estadística. Las alturas de las barreras energéticas que separan las conformaciones definen la escala de tiempo del intercambio conformacional. Esta visión emergente de la estructura y dinámica de las proteínas proporciona un marco teórico para estudiar embudos de plegamiento de proteínas, selección conformacional, alosterismo, unión al ligando, evolución y por lo tanto, el objetivo final de comprender el mecanismo de la función biológica de las proteínas. La flexibilidad y dinámica vibracional asociada a cada conformación garantiza las transiciones conformacionales que, debido a su importancia funcional, poseen rasgos conservados evolutivamente. Las técnicas de Análisis de Modos Normales (NMA), Dinámica Molecular (MD) y Análisis de Componentes Principales (PCA) permiten su análisis según los distintos grados de detalles requeridos o el enfoque del estudio realizado. Estas metodologías, junto a las desarrolladas a lo largo de esta tesis, fueron utilizadas para el estudio de la flexibilidad y dinámica de cavidades. La dinámica de las proteínas altera también la geometría y el tamaño sus cavidades. Los túneles y cavidades de proteínas suelen jugar un rol crítico en su función biológica. Tanto el reconocimiento y la unión a ligandos, como las actividades de transporte y catálisis enzimática requieren, comúnmente, reorganizaciones de las cavidades. Debido a este rol funcional, la flexibilidad y dinámica de las cavidades debe estar garantizada por la dinámica vibracional de las proteínas. En esta tesis, presentamos un método novedoso para caracterizar la dinámica de las cavidades de proteínas en términos de su vector de gradiente de volumen. Para este propósito, hacemos uso de algoritmos para el cálculo del volumen de la cavidad que resultan robusitos para las diferenciaciones numéricas. El vector de gradiente de volumen se expresa de coordenadas colectivas, tanto modos de PCA o NMA. Analizamos las contribuciones de las distintas coordenadas colectivas al vector de gradiente de volumen de acuerdo con su frecuencia y grado de deslocalización. En todos nuestros casos de prueba, encontramos que los modos de baja frecuencia juegan un papel crítico junto con contribuciones menores de los modos de media frecuencia. Estos modos implican, principalmente, movimientos concertados de los residuos que recubren la cavidad estudiada. Mostramos que las proteínas cuyas fluctuaciones colectivas de baja frecuencia contribuyen más a los cambios en el volumen de la cavidad exhiben cavidades más flexibles. En resumen, el método desarrollado en esta tesis permite realizar estudios de la relación entre las fluctuaciones de la proteína y los cambios en el volumen de sus cavidades, analizar y comparar flexibilidades de cavidades y estudiar su dinámica ante cambios conformacionales de la proteína. Esto implicó el desarrollo completo de un nuevo software, ya que ninguno de los métodos preexistentes nos permitió darle este enfoque al trabajo de tesis. En la segunda parte de la tesis, aplicamos la metodología desarrollada al estudio del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). El EGFR es un receptor prototípico de la superficie celular que desempeña un papel clave en la regulación de la señalización celular, la proliferación y la diferenciación. Las mutaciones de su dominio de quinasa se han asociado con el desarrollo de una variedad de cánceres y, por lo tanto, ha sido el objetivo del diseño del fármaco. Se ha comprobado que las sustituciones de aminoácidos individuales (SAS) en este dominio alteran el equilibrio de las poblaciones preexistentes. A pesar de los avances en las descripciones estructurales de sus llamadas conformaciones activas e inactivas, los aspectos dinámicos asociados que los caracterizan aún no se han estudiado a fondo. Como los comportamientos dinámicos y los movimientos moleculares de las proteínas son importantes para una comprensión completa de sus relaciones estructura-función, presentamos un procedimiento novedoso, utilizando el Análisis de Modos Normales (NMA), para identificar la dinámica colectiva compartida entre diferentes confórmeros en EGFR quinasa. El método permite la comparación de patrones de modos vibracionales de baja frecuencia que definen direcciones representativas de movimientos. Nuestro procedimiento puede enfatizar las principales similitudes y diferencias entre las dinámicas colectivas de los diferentes confórmeros. En el caso de la quinasa de EGFR, se han encontrado dos direcciones representativas de los movimientos como huellas digitales dinámicas de los confórmeros activos. El movimiento de la proteína en ambas direcciones revela tener un impacto significativo en el volumen de la cavidad del bolsillo principal del sitio activo. De lo contrario, los confórmeros inactivos exhiben una distribución más heterogénea de los movimientos colectivos. Otro caso de aplicación de los métodos desarrollados fueron las proteínas de unión a lípidos (LBP). Las LBPs son proteínas solubles responsables de la absorción, transporte y almacenamiento de una gran variedad de moléculas lipofílicas, como ácidos grasos, esteroides y otros lípidos en el entorno celular. Entre las LBPs, las proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) presentan afinidades de unión preferenciales por los ácidos grasos de cadena larga. Mientras que la mayoría de las FABPs en vertebrados e invertebrados presentan estructuras similares de barril β con ligandos alojados en su cavidad central, los gusanos nematodos parásitos exhiben proteínas adicionales de unión a retinol y ácidos grasos ricas en hélice α que son inusuales (FAR). En esta tesis, informamos la comparación de simulaciones de dinámica molecular extendida realizadas en los estados de enlace de ácido libre de ligando y palmítico del Necator americanus FAR-1 (Na-FAR-1) con respecto a otras FABPs clásicas de barril β. El análisis de componentes principales (PCA) se ha utilizado para identificar las diferentes conformaciones adoptadas por cada sistema durante las simulaciones MD. La estructura compuesta por hélices α abarca una compleja cavidad interna de unión a ligando con una notable plasticidad conformacional que permite el cambio reversible entre estados distintos en el holo-Na-FAR-1. La cavidad puede cambiar hasta un tercio de su tamaño por cambios conformacionales del complejo proteína-ligando. Además, el ligando dentro de la cavidad no está fijo sino que experimenta grandes cambios conformacionales entre conformaciones plegadas y estiradas. Estos cambios en la conformación del ligando siguen a los cambios en el tamaño de la cavidad dictados por la conformación transitoria de la proteína. Por el contrario, el complejo proteína-ligando en las FABP de barril β fluctúa alrededor de una conformación única. La cavidad ligando holo-Na-FAR-1 significativamente más flexible explica su multiplicidad de ligando más grande con respecto a las FABP de barril β. Para todo esto, en el marco de la presente tesis doctoral, se han desarrollado técnicas que permiten identificar y caracterizar aspectos de la dinámica vibracional de proteínas, directamente vinculados a la flexibilidad y dinámica de cavidades y su conexión con la flexibilidad y dinámica del resto de la estructura proteica. También se ha estudiando la manera de comparar subespacios de modos normales específicos para distintos confórmeros de una proteína. También hemos avanzado en el desarrollo del método de ANA (Analysis of Null Areas) que permite establecer una conexión entre las fluctuaciones térmicas y cambios en las cavidades de las proteínas que permite analizar el impacto que tienen los desplazamientos de la estructura proteica en direcciones predefinidas sobre el volumen de las cavidades. Estas direcciones predefinidas pueden ser coordenadas colectivas de relevancia para la función biológica de la proteína. El método de ANA se facilita a la comunidad científica por medio de un software curado, documentado y un sitio oficial de soporte ANA.