Grandes rearreglos del cromosoma X : el modelo de hemofilia

Abstract

Después de la revolución científica y tecnológica que atravesó la genética médica en los últimos años, el gran desafío que hoy enfrenta es hacer llegar sus beneficios a todos los estratos de la sociedad. La hemofilia, coagulopatía hereditaria ligada al cromosoma X (X), afecta a uno de cada 5000 varones hemicigotas en todas las poblaciones humanas y muy raramente a las mujeres portadoras. Mutaciones deletéreas en el gen del F8 (187kb, 26 exones) causan hemofilia A (HA) que es cinco veces más frecuente que la hemofilia B (HB) causada por defectos en el F9 (33kb, 8 exones). Esta diversidad de tamaño y complejidad del F8 y F9, y la heterogeneidad de defectos genéticos que los afectan, determinaron que la hemofilia sea una enfermedad modelo para el diagnóstico molecular, para los desarrollos terapéuticos y para los estudios de correlación genotipo-fenotipo. La mutación más importante en hemofilia es la inversión del intrón 22 (Inv22), la causa del 42% de las HA severas (actividad del FVIII:C<1%). La Inv22, se origina por recombinación homóloga no alélica (NAHR) entre un segmento de 9,5kb ubicado en el intrón 22 del F8 (int22h-1) y una copia de orientación invertida ubicada cerca del telómero Xq. La recombinación de int22h-1 con una tercera copia de int22h extra-F8 y orientada igual podría generar deleciones (Del22) y duplicaciones (Dup22). Las grandes deleciones (GD) del F8/F9 afectan el 8-15% y 3-6% de las HA y HB severas, respectivamente, y se asocian con muy alto riesgo a desarrollar inhibidor, complicación que encarece la terapia antihemofílica. Con objetivos focalizados en el estudio de los grandes rearreglos genómicos tomando a la hemofilia como modelo, este trabajo incluye análisis epidemiológico-moleculares de los rearreglos de int22h, el desarrollo de un nuevo abordaje costo-efectivo para el diagnóstico de portadoras de GD en enfermedades ligadas al X y la caracterización de los mecanismos involucrados en el origen de las GD parciales del F8. En 267 pacientes Argentinos con HA severa, la prevalencia de la Inv22 fue estimada en 44% (n=126, 109 correspondientes a la Inv22 tipo I, Inv22-I, (38%) y 17 (6%) al tipo-II, Inv22-II). La Dup22 y la Del22 no fue encontrada en un total 703 X de familias Argentinas con HA severa e individuos de la población general estimando un q<1/476≈0,2% en la Dup22 (475 resulta de 540 X con posibilidades de presentar la Dup22 de los cuales 65 X quedaron indeterminados) y un q<1/185≈0,5% en la Del22 (184 fueron los X excluidos). Dos nuevas variantes (v) de la Inv22 derivadas de la Inv22-I e Inv22-II fueron identificadas en cuatro pacientes con HA severa asociadas independientemente al alelo G del SNP rs73563631 modificando los patrones restricción BclI y el abordaje de inverse shifting-PCR versión 2008 (IS-PCR/2008), el más usado internacionalmente para el diagnóstico de la Inv22. La prevalencia de la Inv22v fue estimada en 1,3% de los pacientes con HA severas (4/306) (3 con Inv22-Iv, 1,0%; y 1 con la Inv22-IIv, 0,30%) y en 2,7% de los pacientes con la Inv22 (4/149). Fue desarrollada y validada una modificación del abordaje IS-PCR/2008 haciendo posible el diagnóstico certero de las Inv22v en hemicigosis y heterocigosis (las tres madres de los pacientes informativos y una tía resultaron portadoras y una tía materna resultó no portadora). El monitoreo de 404 X de la población Argentina general resultó negativo para el alelo rs73563631*G estimando una frecuencia q<0,24%. El diagnóstico portadoras de GD en mujeres en-riesgo en familias informativas está asociado a técnicas muy costosas como los microarreglos (SNP-CGH) o MLPA, muy trabajosas como gap-PCR (identificando una señal específica de la GD), o no validadas como PCR cuantitativa en tiempo-real (qPCR). Se diseñó y desarrolló un sistema de medición relativa de dosis génica (T/R, blanco/referencia, X/autosoma) basado en qPCR para el diagnóstico de GD en cuatro regiones del X (i.e., F8 exón 1, 6 y 26; y F9 exón 8) para mujeres en riesgo de familias informativas con HA/HB severa. El abordaje fue validado en dos instancias: (a) verificando la capacidad del método para diferenciar entre simple (T/R, 1:2) y doble dosis (2:2) en 15 varones y 15 mujeres de la población general, respectivamente sin solapar ninguno de los valores T/R de varones con las mujeres control, y (b) comparando los resultados qPCR en las cuatro regiones analizadas con los obtenidos por otros abordajes validados (MLPA, gap-PCR). La distribución de los valores T/R en las dos poblaciones control permitieron calcular la probabilidad de portadora de una GD (Pc) aportando límites de confiabilidad diagnóstica sobre base experimental. La aplicación del método de qPCR en 14 mujeres en riesgo de siete familias con HA o HB severa permitió diagnosticar nueve de ellas como portadoras (Pc>99%) y cinco como no portadoras (Pc<1%) de GD: en el F8, siete portadoras de HA y dos no portadoras; y en el F9, dos portadoras de HB y tres no portadoras. La caracterización de GD genómicas es escasa en la literatura médica incluyendo a la hemofilia. La amplificación de 38 productos PCR en el F8 en nuestra serie de pacientes con HA severa permitió identificar 10 familias con GD. Cada una de estas GD se caracterizaron aplicando primero abordajes de amplificación de mojones con acercamiento a las rupturas por bipartición, y con estos resultados, diseñando y obteniendo una señal específica de cada GD en el probando hemicigota y secuenciación de Sanger. Si bien el análisis de los puntos de ruptura reveló patrones asociados a inestabilidad cromosómica, secuencias estimuladoras de rupturas de doble o simple cadena y secuencias generadoras de estructuras secundarias en el ADN no se detectaron patrones comunes específicos que se repitieran en todos los casos. El 80% de los casos mostró elementos repetitivos interdispersos (e.g., LINE, Alu, LTR) en por lo menos uno de los puntos de ruptura confirmando la inestabilidad que representa su presencia en el genoma humano. Aplicando el principio de máxima parsimonia fue posible estimar el mecanismo involucrado en el origen de cada una de las 10 GD caracterizadas (notación HGSV, archivo del F8 NM_000132.3). Un caso asociado a MMBIR (microhomology-mediated break induced repair): Ex7_12del c.[787+9445_1903+1662del23013; 787+9454insTGTATCCCA]. Un caso asociado a FoSTeS (fork stalling template switching): Ex1del compleja c.[-3058_143+12715del15914{-3058_-3059insGTCTCG}; 143+12761_143+14363del1602; 143+14363_143+14425inv; 143+14425_143+20543del6118]. Dos casos asociados a NHEJ (non-homologous end joining): Ex3_26del c.[265+1220_*4636del165297;265+1220_265+1221insAG]; y Ex1del-parcial c.[-2047*_16del2067]. Seis casos asociados a MMBIR o secundariamente a NHEJ: Ex24_26del c.[6620_*13083del39118]; Ex10del c.[1443+3589_1537+1841del3147]; Ex6del c.[669+605_787+2590del4535]; Ex7_18del c.[1443+1010_5998+1279del62333]; Ex5_7del c.[601+2979_1009+745del21380]; y Ex1del-68kbdel c.[-66732*_271+11409del78145]. Esta serie de 10 GD del F8 representa la más grande descripta en HA hasta el presente. Los resultados y desarrollos metodológicos presentados en este trabajo demuestran que los beneficios de la genética molecular humana pueden ser aplicados a todos los segmentos sociales en forma costo-efectiva aún en países con restricciones económicas.