Desarrollo de nuevos vectores para la obtención de plantas transplastómicas resistentes a patógenos
Resumen
En el marco de este trabajo de tesis doctoral, se encaró el desarrollo de un novedoso sistema de expresión de proteínas heterólogas mediante transformación del genoma plastídico, para ser utilizado con diferentes aplicaciones, entre ellas obtener plantas resistentes a patógenos. Por un lado, nos propusimos obtener un sistema inducible de expresión de proteínas heterólogas en el cloroplasto, que incluye elementos de Quorum sensing (QS) bacterianos. Esta estrategia nos permitiría obtener plantas resistentes a patógenos mediante la expresión de proteínas con actividad antimicrobiana, inducidas por las homoserin lactonas (AHLs) producidas por los patógenos que infectan la planta. Además, se evaluó la posibilidad de expresar en los plástidos proteínas relacionadas a la patogénesis (PR) como estrategia para obtener plantas resistentes a diversos patógenos y finalmente decidimos transformar el genoma plastídico de N. benthamiana, para ser utilizada como planta modelo en estudios con patógenos para los cuáles N. tabacum es no hospedante.
Se diseñaron y desarrollaron los vectores del sistema inducible por AHLs, señales químicas involucradas en el mecanismo de QS bacteriano. En los vectores desarrollados la activación de la expresión génica está bajo el control del promotor del gen LasB, que responde a los reguladores transcripcionales LasR y RhlR cuando estos se encuentran en presencia de las AHLs correspondientes, y permitiendo la expresión de la secuencia codificante uid-A (codifica la proteína reportera β-glucuronidasa). Se comprobó la integración de la construcción genética y la correcta expresión de los reguladores LasR y RhlR en las plantas transplastómicas.
Mediante la aplicación exógena de AHLs sintéticas a plantas transplastómicas se visualizó la inducción del sistema, sin embargo, no se pudo reproducir este resultado. Desafortunadamente no se pudo visualizar actividad β-glucuronidasa en las plantas transgenicas que expresan los reguladores transcripcionales LasR y RhlR.
Se caracterizaron molecularmente, y se evaluó la efectividad frente a patógenos, de las plantas transplastómicas de tabaco transformadas con construcciones diseñadas para acumular las proteínas PR AP24 y β-1,3-glucanasa en el estroma de los plástidos (utrAP24-Gluc). Se demostró que estas plantas poseen una alta resistencia frente al ataque de hongos y oomicetes en condiciones de invernadero y de campo. Con estos resultados alentadores, actualmente estamos realizando experimentos de bombardeo con el plaásmido utrAP24-Gluc para la transformación del genoma plastídico de papa.
Finalmente se estableció la metodología para la transformación de cloroplastos de N. benthamiana con el vector pBSW-utrGUS diseñado para transformar N. tabacum. Se obtuvieron las primeras plantas transplastómicas que expresan la proteína reportera GUS que están siendo analizadas. En la actualidad, se están realizando ensayos de transformación del genoma plastídico de N. benthamiana con el plásmido utrAP24-Gluc, con el objetivo de generar una nueva herramienta para evaluar estrategias de resistencia a patógenos para los cuáles el tabaco no es un modelo adecuado.