Nanoadyuvantes para ruta mucosa a partir de fuentes sustentables de lípidos

Abstract

Este trabajo de Tesis Doctoral describe el diseño y caracterización de liposomas preparados con lípidos aislados de arquebacterias (ARQ) para generar respuestas inmunes antígeno-dependientes por la ruta oral en modelos animales de laboratorio. Para ello, se comenzó con el aislamiento y la amplificación en medio salino (3,5 M) de arquebacterias a partir de muestras de suelo de Salina Chica (Península de Valdez, Chubut, Argentina). Las mismas se identificaron como H. tebenquichense. Los lípidos polares totales (LPT) se extrajeron y caracterizaron por cromatografía en capa delgada mono y bidimensional (TLC-1D y 2D) y espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS). La mezcla de LPT estaba compuesta por: los fosfolípidos arqueales 2,3-di-O-fitanil-sn-fosfatidilglicerofosfato metil éster (PGP-Me) y 2,3-di-O- fitanil-sn-fosfatidilglicerol (PG); la cardiolipina sn-2,3-di-O-fitanil-1-fosfoglicerol-3-fosfo-sn-di-O-fitanilglicerol (BPG); el sulfoglicolípido, 1-O-[α-D-manosa-(2’-SO3H)-1’→2’)-α-D-glucosa]-2,3-di-O-fitanil-sn-glicerol (S-DGD-5) y la cardiolipina glicosilada (S-DGD-5-PA). Con los LPT aislados se planteó una primera aproximación para evaluar la factibilidad de obtención de arqueosomas (ARQ) empleando homogeneización de alta presión (HPH) aplicando un DoE multivariado. Los resultados demostraron que los ARQ ofrecieron una gran resistencia a la disminución del tamaño por HPH. Esto podría deberse a la hidrofobicidad de los arqueolípidos y la presencia de cardiolipinas arqueales que conferirían una mayor rigidez a la membrana. Y por último, se prepararon ARQ con ovoalbúmina (OVA), como proteína modelo, a escala laboratorio para evaluar métodos de caracterización estructural de las vesículas obtenidas utilizando propilenglicol (Pg) para aumentar la incorporación de la proteína. Los ARQ obtenidos tuvieron un tamaño menor a 200 nm (ZAve) y su PdI fue menor a 0,300. El potencial Z fue menor a -30 mV, lo que justificaría la estabilidad física en suspensión de estas vesículas. En todos los casos las Tm y pre-Tm fueron menores a -20°C. La incorporación de proteína no mejoró con el uso de Pg y la relación proteína/lípido fue de ≈0,100 mg/mg. Luego, se utilizaron técnicas para el análisis de la captura y tráfico intracelular de ARQ, en células J774A.1, como modelo de macrófago y en células Caco-2, como modelo de enterocito. Para lo cual se utilizaron inhibidores de las diferentes rutas endocíticas y se cuantificó la internalización de los ARQ fluorescentes a través de la citometría de flujo. Estos estudios fueron complementados por microscopía confocal láser de barrido (MCLB) para determinar la co-localización con Lysotracker®, marcador de organelas ácidas. Los resultados revelaron que aparentemente, las células Caco-2 capturarían ARQ mediante endocitosis mediada por caveolina y macropinocitosis. Además, se halló que las células J774A.1, capturaron ARQ no sólo mediante la clásica fagocitosis, sino también por endocitosis mediada por clatrina y por caveolina. Los LPT utilizados para la preparación de estos ARQ no poseen arquetidilserina en su composición pero fueron ávidamente capturados por las células J774A.1. De un modo alternativo se podría postular la manosa terminal de los arqueolípidos SDGD-5 y SDGD-5-PA que interactuaría con receptores específicos presentes en APC para favorecer su captura. Este trabajo es el primero que muestra estudios in vitro sistemáticos sobre las vías de internalización y tráfico intracelular de ARQ en líneas celulares no fagocíticas. También se realizó un estudio comparativo de la capacidad de unión a células M de los ARQ preparados exclusivamente con arqueoles aislados de H. tebenquichense, respecto a liposomas de fosfatidilcolina de soja/colesterol, mediante un modelo in vitro de barrera epitelial mucosa utilizando dispositivos Transwell®. La fluorescencia, luego de 1 y 2 horas de incubación con ARQ marcados en el interior acuoso con un colorante piranínico fluorescente (HPTS) y la bicapa lipídica con RhPE, fue 4 veces mayor que la observada con liposomas marcados del mismo modo. Además, con muestras de ARQ, el 15% de RhPE y 13% de HPTS se encontraron en el compartimiento basolateral de los Transwell®, espacio equivalente al bolsillo basolateral de las células M. Por el contrario, no se detectó fluorescencia con los liposomas. Estos hallazgos revelarían una mayor velocidad de transcitosis de los ARQ comparado con los liposomas. Los resultados in vitro fueron sustentados por los hallazgos in vivo, donde se determinó la biodistribución del radiofármaco hidrosoluble 99mTc-DTPA incorporado a ARQ versus liposomas después de la administración oral en ratas Wistar. Luego de 4 horas, los ARQ fueron los responsables del 22,3 % (3,5 veces mayor que los liposomas) del 99mTc-DTPA, hallado en circulación. Esta importante cantidad de marcador radiactivo en sangre podría ser consecuencia de la gran captura de los ARQ por las células M in vivo, probablemente favorecida por las características hidrofóbicas de estas vesículas. En suma, estos resultados sugerirían que los ARQ, con una capacidad adyuvante probada por vía parenteral y biocompatibilidad demostrada, podrían ser un adecuado material nanoparticulado para utilizarse como adyuvante por la ruta oral. Y por último, se propuso la incorporación de antígenos solubles de T. cruzi a ARQ (ARQ-Tc) con el objeto de realizar ensayos de inmunización por ruta oral en un modelo de animales de laboratorio. Ratones hembra C3H/HeN se inmunizaron vía oral con una dosis de aproximadamente 200 μg de proteína y/o 2 mg de lípidos en un volumen máximo de 200 μl. El esquema de inmunización fue 0-14-21-63 días. La respuesta humoral se determinó a través del dosaje de anticuerpos clase IgG anti-T cruzi por ensayo inmunoenzimático (ELISA, del inglés Enzyme-linked immunosorbent assay) en fase sólida en muestras de suero. Para evaluar la respuesta inmune a nivel de mucosas se tomaron muestras de saliva y materia fecal y se cuantificó el título de IgA por ELISA. Las vesículas obtenidas (ARQ-Tc y ARQ) tuvieron un tamaño menor a 200 nm y el PdI fue menor a 0,400. El potencial Z fue menor a -30 mV. En los experimentos de digestión in vitro desarrollados se demostró que los ARQ protegerían la proteína incorporada. Además, a través del análisis por ESI-MS, los arqueolípidos evidenciaron una resistencia estructural al ambiente hostil del tracto gastrointestinal en experimentos in vitro, con lo cual los restos de manosa, a quienes se asigna la capacidad adyuvante, no se perderían. Sin embargo, los resultados del ensayo de inmunización mostraron solamente un ratón, perteneciente al grupo que recibió ARQ-Tc, con títulos elevados de IgG sérica (>6400) a partir de la quinta semana (14 dpi). Este título se mantuvo luego de 14 días de la cuarta dosis. En ningún caso se detectaron títulos de IgA en muestras de saliva. En este contexto, se discuten estrategias para encarar futuros abordajes experimentales.