Caracterización estructural y funcional del factor de virulencia IivA de Brucella abortus

Abstract

Brucella spp. son patógenos intracelulares facultativos pertenecientes al grupo de las α-2-proteobacterias. Estas bacterias son el agente etiológico de una enfermedad zoonótica, llamada brucelosis, que infecta tanto a animales domésticos y salvajes, como al humano. Si bien, Brucella spp. no posee factores de virulencia clásicos, mediante técnicas de biología molecular se han identificado numerosas proteínas involucradas en el establecimiento de su virulencia. Estás moléculas frecuentemente están implicadas en la infección, multiplicación y establecimiento del nicho intracelular de la bacteria. En nuestro laboratorio se ha determinado que la mutación knockout del ORF BAB1_1543 de Brucella abortus cepa 2308 afecta drásticamente la virulencia de la misma en ratones BALB/c. Mediante la complementación en trans de dicha cepa mutante con BAB1_1543 salvaje se restaura la virulencia bacteriana a los niveles de la cepa parental. A la proteína codificada por el ORF BAB1_1543 se la denominó IivA y la misma pertenece a un grupo de proteínas ortólogas, el COG 2960, conservado en más de 200 proteobacterias. A pesar de que IivA esta altamente conservada en proteobacterias no se ha identificado su función en ninguna de ellas y el mecanismo por el cual esta proteína contribuye a la virulencia de Brucella spp. se desconoce. Teniendo presentes los datos anteriormente mencionados, el objetivo de este trabajo de tesis es caracterizar estructural y bioquímicamente la proteína IivA, con el fin de contribuir al entendimiento de su función, y establecer si otras proteínas del COG 2960 también están involucradas en la virulencia bacteriana. Mediante el uso de técnicas biofísicas se determinó que IivA es una proteína trimérica, que posee dos dominios estructurales: un dominio C-terminal α-hélice coiled-coil, a través del cual la proteína oligomeriza y un dominio N-terminal que se encuentra desestructurado a pH neutro y es capaz de formar una α-hélice anfipática en diferentes condiciones. Por otro lado se identificó que IivA interacciona con vesículas fosfolipídicas, lo que conlleva a un cambio estructural de la proteína, dando lugar a la formación de una α-hélice anfipática en el dominio N-terminal. La estructura de IivA es característica de proteínas involucradas en la fusión de membranas biológicas, por lo que se decidió ensayar la actividad fusogénica de la proteína en membranas fosfolipídicas modelos. De este modo se encontró que IivA es capaz de fusionar membranas, tanto a pH neutro como a pH ácido. Además, se identificó que para que se produzca eficientemente la fusión de membranas es necesaria la proteína en su totalidad, dado que los dominios de IivA por separado no tienen actividad fusogénica o su actividad es mínima. Por otro lado, se caracterizó a la proteína ortóloga a IivA de Salmonella typhimurium: YqiC. Se eligió la γ-proteobacteria S. typhimurium, como un miembro representativo del COG 2960, debido a que, al igual que Brucella spp., es un patógeno intracelular facultativo ampliamente estudiado. De este modo se encontró que las características estructurales y la capacidad de interactuar con membranas fosfolipídicas y producir la fusión de las mismas son conservadas entre IivA e YqiC. Por último se realizo la mutación knockout del gen yqiC en S. typhimurium y se analizó el fenotipo de la cepa mutante. Al igual que lo que sucede con la inactivación del gen iivA de Brucella spp., la inactivación del gen yqiC, disminuye drásticamente la virulencia de S. typhimurium, además de disminuir la resistencia a temperaturas elevadas. Si bien son necesarias futuras investigaciones para establecer la función biológica y el mecanismo específico por el cual las proteínas IivA e YqiC contribuyen a la virulencia de B. abortus y S. typhimurium respectivamente, en este trabajo de tesis se aportan los primeros datos que contribuirán a elucidar la función de un grupo de proteínas ortólogas no caracterizado hasta el momento.