Desarrollo de la comunidad bacteriana del floc biológico de barros activados y respuesta a la desestabilización mediada por agentes externos

Abstract

El tratamiento de efluentes basado en barros activados es el proceso más ampliamente empleado en todo el mundo para el tratamiento biológico de efluentes de origen industrial o domiciliario. El éxito del proceso radica no sólo en la selección de poblaciones bacterianas capaces de degradar los compuestos orgánicos y nutrientes del efluente, sino que también depende de la agregación de las mismas para conformar el floc biológico, posibilitando la separación de la biomasa del líquido depurado por gravedad. En otras palabras, la eficiencia del proceso depende en gran medida de la formación del floc biológico y de su estabilidad frente a agentes que interfieren con la biofloculación. Ambos aspectos fueron estudiados en este trabajo, empleando reactores de barros activados a escala de laboratorio. El objetivo de la primer parte del trabajo fue evaluar la contribución de dos teorías ecológicas contrapuestas para el ensamblado de las comunidades bacterianas durante la formación del floc biológico: la teoría basada en nichos (determinística) y la teoría neutral (estocástica). Inicialmente se diseñaron experimentos para probar que los cambios producidos en la composición de las comunidades bacterianas no se producen totalmente al azar, sino que existe una selección determinada por nichos. Partiendo de una comunidad bacteriana enriquecida en poblaciones planctónicas, distribuida en cuatro reactores replicados, se analizó la dinámica de las comunidades bacterianas durante el desarrollo del floc biológico utilizando la técnica de electroforesis con gradiente desnaturalizante (DGGE, del inglés denaturing gradient gel electrophoresis). Los cambios producidos en las estructuras de las comunidades bacterianas se dieron de manera significativamente similar en los cuatro reactores replicados, lo cual manifiesta un fuerte carácter determinístico. Otra prueba que sustentó esta hipótesis se obtuvo al observar que reactores con comunidades bacterianas con distinta distribución de abundancia de especies convergieron hacia una comunidad significativamente similar luego de 40 días de operación. Por otro lado se evaluó la hipótesis de que el carácter estocástico del ensamblado aumenta con el número de especies en la metacomunidad. Analizando los cambios temporales observados en comunidades de diferente grado de diversidad, se observó que la tasa de recambio de especies aumentó significativamente con el número de especies disponibles. Adicionalmente se observó un mejor ajuste a un modelo de ensamblado neutral, ante el incremento del número de especies disponibles para conformar el floc biológico. Se concluye que tanto la dinámica determinística como la neutral operan en conjunto durante la formación del floc biológico, y que el balance entre ambos procesos depende del tamaño de la metacomunidad. En la segunda parte del trabajo nos enfocamos en la respuesta de la comunidad del floc ante la desfloculación mediada por incrementos puntuales de temperatura o de concentración de fenol. Ambos tipos de perturbaciones ocurren frecuentemente en plantas de tratamiento, provocando una pérdida de sólidos y la consecuente reducción de la calidad del efluente tratado. El objetivo fue determinar si los sólidos que se desprenden del floc corresponden a células de bacterias localizadas en la zona externa del floc, o si las perturbaciones afectan distintivamente las propiedades fisiológicas de miembros internos del floc comprometiendo la estabilidad del agregado. Comparando la estructura de la comunidad bacteriana entre la fracción floculenta y sobrenadante, se determinó que la mayoría de los taxones que forman parte del floc se desprenden inespecíficamente en respuesta a los shocks desfloculantes. Sin embargo, identificamos un taxón perteneciente al género Sediminibacterium que incrementó marcadamente su abundancia en la fracción sobrenadante luego de ambos tipos de shocks. El incremento poblacional de Sediminibacterium sp. no se debió a un desprendimiento distintivo, sino a la activación del crecimiento planctónico ocurrido inmediatamente luego de la disrupción del floc y que se mantuvo luego de una semana de los shocks. Mediante un análisis de hibridación fluorescente in situ se determinó que la población de Sediminibacterium sp. es un componente estable del floc, que se encuentra en baja abundancia y se localiza en zonas internas del mismo. Por otro lado, se logró aislar una cepa de Sediminibacterium sp. en cultivo puro, la cual es microaerófila y, dependiendo de la presencia de piruvato en el medio de cultivo, exhibió la capacidad de crecer en forma agregada o planctónica. Ambas formas de crecimiento fueron comparadas en un análisis proteómico, utilizando el genoma de Sediminibacterium sp. anotado como base de datos para la asignación de los fragmentos peptídicos. Este análisis mostró que el crecimiento planctónico está asociado a una mayor expresión de proteínas relacionadas con estrés. En base a estos resultados se propone un modelo bifásico de desfloculación, por el cual la disrupción inicial del floc, inducida por incrementos bruscos en la temperatura o en la concentración de fenol, expone a la población de Sediminibacterium sp. a concentraciones de oxígeno que activan un mecanismo de respuesta a estrés, resultando en un crecimiento planctónico que afecta notablemente la calidad del efluente tratado.

The activated sludge process is the most widely used method for biological treatment of industrial or domestic wastewater around the world. The success of the process is not only due the selection of bacterial populations capable of degrading organic compounds and nutrients from the wastewater, but also depends on its aggregation properties, which allows the separation of the biomass from the treated water by gravity. In other words, the efficiency of the process depends greatly on biological floc formation and stability against agents that interfere with the bioflocculation. Both aspects were studied in this work. The aim of the first part of the Thesis was to evaluate the contribution of two contrasting ecological theories for the assembly of bacterial communities during biological floc formation: the niche-based theory (deterministic) and the neutral theory (stochastic). Initially, we designed experiments to prove that changes in composition of bacterial communities do not occur completely at random. Starting from a bacterial community enriched in planktonic populations, we used four replicated reactors to analyze the dynamics of bacterial communities during the formation of the biological floc, using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Changes in the structure of bacterial communities were significantly similar in the four reactors replicated, which suggested a strong deterministic character of the assembly process. Further evidence that supported this hypothesis was obtained by the fact that reactors bacterial communities with different species abundance distribution converged and were significantly similar after 40 days of operation. In addition, we tested the hypothesis that the stochastic nature of the assembly increases with the number of species in the metacommunity. Analyzing temporal changes observed in communities with different levels of diversity, we observed that the rate of species turnover increased significantly with the number of species available. Additionally there was a better fit to a neutral assembly model with the increase of the number of species available to form the biological floc. We conclude that both deterministic and the neutral dynamics, operate together during the biological floc formation, and that the balance between the two processes depends on the size of the metacommunity. In the second section, we focused on the community response to deflocculation mediated by transient increases in temperature or concentration of phenol. Both types of disturbances occur frequently in industrial wastewater treatment plants, causing a loss of solids and an overall reduction of effluent quality. The objective was to determine whether the solids that are released from the perturbed floc are bacteria cells located in the outer zone of the floc, or whether different shocks distinctly affect the physiological properties of internal members of the floc, compromising the aggregate stability. Comparing the bacterial community structure between flocculent and the supernatant fraction, it was determined that most of the taxa that are part of floc deflocculate nonspecifically in response to the shocks. However, we identified a taxa belonging to the genus Sediminibacterium, which markedly increased their abundance in the supernatant fraction after both types of shocks. However, the presence of Sediminibacterium sp. in the planktonic fraction was not due to a distinctive detachment from the floc, but to the steady growth that started immediately after the disruption of the floc and continued after a week of shocks. Fluorescence in situ hybridization showed that the population of Sediminibacterium sp. was a stable component of the floc, which was found in low abundance and was located in inner regions thereof. Furthermore, I isolated a strain of Sediminibacterium sp. in pure culture. The isolate was microaerophilic and, depending on the presence of pyruvate in the culture medium the strain exhibited the ability to grow in autoaggregate or planktonic mode. Both growth forms were compared in a proteomic analysis using Sediminibacterium sp. annotated genome as local database for the peptide fragments identification. This analysis showed that the planktonic growth was associated with an increased expression of stress-related proteins. Based on these results, we propose a biphasic model of deflocculation, in which the initial floc disruption induced by the transient increases in temperature or concentration of phenol, exposes the population of Sediminibacterium sp. to conditions that activates a stress response mechanism, resulting in the massive planktonic growth that significantly affects effluent quality.