Rol del ácido neuramínico glicolilado (NGc) en la biología tumoral : desarrollo de nuevos modelos murinos

Abstract

Se definen como glicoconjugados a las macromoléculas biológicas modificadas mediante el agregado de carbohidratos. Dentro de esta amplia familia de compuestos se incluyen a los gangliósidos, glicolípidos formados por una porción ceramida unida covalentemente a un oligosacárido lineal que puede contener uno o más residuos de ácido siálico (Sia). Los Sias más comunes en mamíferos son N-acetilneuramínico (NAc) y N-glicolilneuramínico (NGc), siendo la única diferencia entre ellos el agregado de un átomo de oxígeno en el residuo N-acetilo del NAc, catalizado por la enzima CMAH (CMP-NAc hidroxilasa). Los gangliósidos se distribuyen en la superficie celular formando agregados específicos denominados microdominios de membrana. Como integrantes de estas estructuras, ha sido reportado que participan como intermediarios en el flujo de información que ocurre entre el exterior e interior celular al asociarse con diversas proteínas de la membrana y modular múltiples rutas de señalización. Debido a una mutación en el gen CMAH, normalmente no se detectan glicoconjugados que presenten NGc en los tejidos humanos sanos. Sin embargo, se describió la expresión de este ácido siálico en una gran variedad de tumores. La hipótesis más aceptada para explicar este fenómeno propone que debido a un incremento en su capacidad metabólica, las células tumorales son capaces de captar e incorporar NGc del microambiente, el cual se hace presente debido a la ingesta dietaria en particular de carnes y leche. Numerosos trabajos indican que la presencia de NGc en células transformadas les proporciona ventajas adaptativas relacionadas principalmente con la capacidad de evasión del sistema inmune. Considerando la exclusiva expresión en células tumorales y teniendo en cuenta el papel que representan para la biología tumoral, NGc y particularmente el gangliósido NGcGM3 han sido postulados como blancos específicos contra los cuales dirigir inmunoterapias oncológicas. En el presente trabajo se desarrollaron modelos murinos de expresión de NGcGM3 con el fin de llevar adelante ensayos preclínicos de dos vacunas dirigidas a dicho gangliósido. Adicionalmente, se estudió la participación de NGcGM3 en la biología de las células tumorales utilizando un modelo murino de melanoma. Buscando desarrollar modelos murinos de expresión de NGc, mediante la transfección de la secuencia de CMAH se obtuvieron células de melanoma B16 y carcinoma mamario F3II con expresión de NGcGM3, denominadas B16-H y F3II-H respectivamente. Un tercer modelo desarrollado consistió en la preincubación de células de carcinoma pulmonar de Lewis 3LL con NGc purificado (3LL-NGc), de manera de lograr la expresión de NGcGM3 en la superficie celular. Los resultados demostraron que la presencia de NGcGM3 en células B16-H induce un incremento en la expresión de integrina α5 en la membrana plasmática y, como consecuencia, una mayor capacidad adhesiva. Por su parte, se observó el descenso e internalización hacia el espacio citoplasmático de cav-1, una proteína de membrana involucrada en la organización de moléculas que participan en procesos de señalización celular. Esto se asoció con una disminución en la expresión de la kinasa Src y la Rho-GTPasa Rac1. Sin embargo, la proliferación celular se encontró incrementada en estas células sugiriendo la activación de vías de crecimiento independientes de anclaje como consecuencia de la expresión de NGcGM3. En los modelos F3II-H y 3LL-NGc se observaron resultados similares en cuanto a la proliferación y adhesión celular. Los resultados obtenidos sugieren que el aumento de NGcGM3 en la membrana plasmática, como posiblemente de otros glicoconjugados con residuos N-glicolilados, promueve la malignidad celular in vitro mediante la alteración en la estructura y/o composición de microdominios de membrana. Los ensayos de crecimiento tumoral in vivo permitieron determinar que la tumorigenicidad de células B16-H y F3II-H, con expresión estable de NGcGM3, se encontró disminuida en comparación con las líneas parentales. Cuando F3II-H fue inoculada en ratones atímicos, no se observaron diferencias en las curvas de crecimiento de los tumores desarrollados al comparar con F3II. Por otro lado, la incorporación de NGc a células 3LL incrementó su potencial metastásico, observándose una mayor cantidad de nódulos formados en el pulmón cuando son inoculadas en animales singénicos por vía i.v. Estos resultados permiten postular que la expresión estable de NGcGM3 en células de melanoma y mama induciría una respuesta inmunológica por parte del animal. Contrariamente, la expresión transitoria, durante los primeros días del desarrollo tumoral, podría promover la progresión del tumor. Por último, los modelos B16-H y 3LL-NGc fueron empleados en la valoración de la actividad antitumoral de las vacunas NGcGM3/VSSP y racotumomab, respectivamente. Ambos preparados resultaron efectivos contra el desarrollo de tumores y dependientes de la expresión del blanco NGcGM3. Se obtuvieron evidencias que demuestran la factibilidad de la combinación de racotumomab con quimioterapia estándar, así como también la inducción de anticuerpos anti-NGcGM3 capaces de reconocer al tumor luego de la vacunación con la misma. El presente trabajo pone de manifiesto la importancia que presenta el uso de modelos murinos adecuados en la investigación oncológica. Su correcto desarrollo permite comprender el papel que desempeñan blancos específicos como éste en la biología tumoral, así como también entender y validar el mecanismo de acción de terapias novedosas dirigidas contra los mismos. Los datos experimentales presentados en esta tesis refuerzan el significado biológico del gangliósido NGcGM3 como un blanco para inmunoterapia.