Diseño y desarrollo de estrategias de análisis molecular de importancia diagnóstica y pronóstica en neoplasias mieloproliferativas crónicas

Abstract

Las neoplasias mieloproliferativas crónicas (NMPs) son un grupo heterogéneo de patologías hematológicas que se caracterizan por la proliferación de alguno de los linajes mieloides: eritroide, megacariocítico o granulocítico. Entre las neoplasias mieloproliferativas se encuentra la Leucemia Mieloide Crónica [LMC BCR- ABL1 (+)] y las neoplasias mieloproliferativas BCR-ABL1 negativas clásicas [NMPs BCR-ABL1 (-)] incluyendo: Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Esencial (TE) y Mielofibrosis Primaria (MP). En este trabajo de Tesis se analizó el perfil de expresión de los genes BCR-ABL1, BAX, BCL-XL, CAMKIIγ, KI-67, HSP70 y HSP90 en LMC con el objetivo de caracterizar el nivel de transcripción de los mismos y su asociación con resistencia al tratamiento con inhibidores de tirosina quinasa. La expresión de los genes mencionados se realizó a partir de muestras de leucocitos de sangre periférica de 101 pacientes con LMC en diferentes etapas de la enfermedad: Debut, Fase Crónica en Remisión (FC Rem), Fase Crónica No respondedora (FC No Resp), Fase Avanzada (FA) y en 20 individuos sanos. Los niveles de transcriptos BCR-ABL1/ABL1 correlacionan positivamente con las fases de la enfermedad. Se observó que los pacientes con LMC al diagnóstico, en FC No Resp y en FA presentaban un perfil de expresión génica característico. Observándose que la relación BAX/BCL-XL era menor mientras que la expresión de los genes CAMKIIγ, KI67, HSP70 y HSP90 era significativamente mayor al diagnóstico, en FC No Resp y en FA respecto de la FC Rem, indicando que el perfil de expresión de los genes mencionados se asociaría a respuesta al tratamiento y/o factores pronósticos. Cuando los pacientes en FC No Resp y en FA fueron reagrupados en función de la presencia de mutaciones en el dominio quinasa del gen ABL1, el estudio del perfil transcripcional demostró un aumento de la expresión de los genes CAMKIIγ y HSP70 y una disminución en el nivel de HSP90 en el grupo de pacientes mutados (MT) respecto del grupo no mutado (WT), mientras que BCR-ABL1, KI67 y la relación BAX/BCL-XL no presentaron diferencias. La expresión diferencial de los genes: CAMKIIγ, HSP70 y HSP90 permitió diseñar un score según la fórmula [CAMKIIγ+HSP70-HSP90]. Se determinó un punto óptimo de corte (cut-off: 1,1) empleando curvas ROC (receiver operating characteristic). Valores mayores a 1,1 tienen 6 veces más probabilidades (OR (IC95%)) de presentar mutaciones que valores menores (p<0.002). El estudio de los niveles de expresión de los genes CAMKIIγ, HSP70 y HSP90 y la elaboración del Score permitieron realizar un screening de mutaciones en forma rápida, específica y costo- efectiva en pacientes resistentes al tratamiento con ITKs. Respecto a las NMPs BCR-ABL (-), éstas se caracterizan por la presencia de una mutación somática adquirida en el exón 14 del gen JAK2 la cual resulta en una sustitución del residuo valina por el de fenilalanina en la posición 617 (p.617). La mutación JAK2V617F involucra el dominio pseudoquinasa JH2, región que inhibe la actividad quinasa de JAK2 y como resultado, la proteína JAK2 permanece constitutivamente fosforilada activando distintas vías de señalización. Se ha podido demostrar que debido a un mecanismo de recombinación mitótica se produce pérdida de heterocigosidad a nivel de 9q24 (LOH: Loss: of Heterocygozity), lo cual determina homocigosidad de la mutación determinando variaciones en la carga alélica. El análisis de la homo o heterocigosidad de la mutación aplicando métodos cuantitativos es un tema de relevancia por sus posibles implicancias clínicas. Por lo tanto el objetivo de este capítulo fué el desarrollo de un constructo molecular que posibilitó una mayor precisión en la cuantificación de la mutación JAK2V617F. La utilización de los constructos MT: WT 1:1, permitió reducir los eventuales sesgos en el cálculo de la carga alélica (CAL) de la mutación V617F alrededor del 50%. Se estimó un valor límite (media + 2xDS), a partir de donantes sanos de 3,65% el cual detectó la presencia de la mutación JAK2V617F en las NMPs con mayor sensibilidad que el método cualitativo ARMS-PCR (≥ 6,7%) La qPCR empleando los constructos moleculares desarrollados, permitió una estimación rápida y precisa de la carga alélica y de la expresión de la mutación JAK2V617F en 19 casos positivos para la mutación, detectando 13 casos con clones homocigotas [CALg ≥ 56,73% (media+SD)]. La carga alélica y el nivel de expresión de la mutación JAK2V617F mostraron una correlación significativa positiva (Spearman r=0,53, p=0,02) en la mayoría de los casos estudiados. Sin embargo en un 22% de los casos se observó un incremento en los transcriptos JAK2V617F lo cual podría asociarse a una expresión aumentada o sobreexpresión de la mutación. Estos estudios permiten cuantificar la mutación a nivel genómico y transcripcional lo cual puede tener gran relevancia clínica en las NMPs.