Detección prospectiva y sistemática de la enfermedad mínimamente diseminada en pacientes con retinoblastoma de alto riesgo mediante marcadores moleculares y la determinación de su valor pronóstico

Abstract

El retinoblastoma es la neoplasia intraocular más común en la infancia. Si bien la sobrevida en la Argentina es mayor del 90%, la diseminación extraocular continúa siendo la causante fatal principal en el país y en los países en desarrollo. Una herramienta pronóstica que permitiría determinar la posibilidad de recidivar en forma potencialmente más sensible y específica que la histología del globo ocular enucleado (el método usado en la actualidad), sería la evaluación de la enfermedad mínimamente diseminada (EMD) en los pacientes enucleados de alto riesgo. El objetivo final fue poder evaluar la posibilidad de identificar tempranamente a los pacientes en alto riesgo para poder administrarles una terapia más intensiva y dirigida al Sitema Nervioso Central (SNC) donde las recaídas son fatales. Para esto, la parte inicial del trabajo se basó en la búsqueda de biomarcadores para la EMD. Así, se estudió la detección del ARN mensajero (ARNm) de la GD2 sintasa como marcador de la EMD por retrotranscripción seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y Nested-PCR (o anidada), a partir de muestras citológicamente negativas de líquido cefalorraquídeo (LCR) de 26 pacientes con retinoblastoma de alto riesgo. En este trabajo la médula ósea (MO) no fue evaluada, ya que este tejido presenta expresión del gangliósido GD2 y por lo tanto de su sintasa, por lo que se decidió buscar otro biomarcador más específico. De este modo, en la siguiente parte de este trabajo, se diseñó una metodología más específica que permitiera evaluar un biomarcador más sensible y específico. El biomarcador molecular seleccionado es específico de linaje y se corresponde con el factor de transcripción de conos y bastones con caja homeótica (CRX: por su nombre en inglés Cone-Rod Homeobox-containing gene) cuya expresión por las células de retinoblastoma primario y también por células diseminadas fue reportado por otros grupos por inmunohistoquímica y por el nuestro, por técnicas moleculares. Una vez seleccionado este biomarcador como el más sensible y específico, se realizó un estudio en pacientes con retinoblastoma metastático, estudiando la MO de los pacientes (n=17) con enfermedad metastásica al diagnóstico (n=9) o a la recaída (n=8) probada mediante biopsia, basada en RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR). El objetivo fue evaluar su utilización como herramienta para la optimización del pronóstico y evaluación de la respuesta al tratamiento mediante la detección de la EMD. En una etapa ulterior, se analizó el uso de CRX para detectar la EMD en muestras de MO y LCR de 96 pacientes prospectivamente estudiados (14 LCR se estudiaron con la GD2 sintasa) con retinoblastoma intraocular (no-metastásico) y factores de riesgo en la histopatología. El objetivo fue evaluar si la EMD era detectable en la enfermedad intraocular, detectar características clínicas o patológicas que predigan la EMD, y evaluar su impacto pronóstico en la sobrevida libre de enfermedad (SLE). Con los resultados obtenidos en la primera parte del trabajo se demostró que la presencia del ARNm de la GD2 sintasa y, por lo tanto de la EMD, está vinculada directamente al riesgo de recaída extraocular. Se sentaron las bases sobre el concepto de que la EMD está presente en el LCR de pacientes con retinoblastoma sin compromiso del SNC al diagnóstico y, especialmente, en aquellos quienes presentan compromiso masivo del nervio óptico y glaucoma; algunos de los cuales pueden salvarse con terapia intensiva, lo que justificaría un protocolo de toma de muestras más intensivo. En la segunda parte, se comprobó que el ARNm del gen CRX es un marcador novedoso en el retinoblastoma diseminado, que sirvió como herramienta no sólo para mejorar la identificación de células tumorales en sitios extraoculares sino que permitió dilucidar mecanismos de diseminación de este tumor ya que, la recaída en el LCR no estaría relacionada con la diseminación sistémica del retinoblastoma en vista de la rápida, completa y sostenida respuesta en MO metastásica luego de la quimioterapia de inducción. En todos los pacientes con metástasis secundaria, la recaída en el LCR ocurrió independientemente de los hallazgos en la MO, sugiriendo que el LCR sería como un sitio santuario. En la última sección, se logró identificar una población de pacientes con “muy alto riesgo” y factores de riesgo en la histopatología quienes presentaban la EMD y en quienes la SLE es significativamente menor a pesar de la terapia adyuvante intensiva. En este subgrupo, se encontró que cerca de un 10% de los pacientes que se presentan con enfermedad clínicamente localizada, tienen diseminación molecular, en especial aquellos que tienen invasión del nervio óptico incompletamente resecado y en los que se presentaron con glaucoma. Por último, se halló que los pacientes con retinoblastoma grupo E y glaucoma tienen un riesgo mayor de tener la EMD al diagnóstico y no deberían ser considerados para candidatos a la terapia conservativa.

Retinoblastoma is the most common intraocular malignancy in childhood. While survival in Argentina is above 90%, extraocular dissemination still remains as the fatal leading cause both in this country and in developing ones. A prognostic tool that would determine in a potentially more sensitive and specific manner than the enucleated-eyeball histology (the method used at present) that a relapse may occur, would be the evaluation of the minimal disseminated disease (MDD) in enucleated patients at high risk. The final objective consisted of being able to evaluate the possibility of the early identification of those patients at high risk who might receive a more intensive and Central Nevous System (CNS)-directed chemotherapy, where relapses are typically more fatal. In this regard, the initial part of this work was addressed to the searching of biomarkers for the MDD. The detection of GD2 synthase mRNA as a marker of MDD by reverse transcription followed by polymerase chain reaction (RT-PCR) and Nested-PCR on cytologically negative samples of cerebrospinal fluid (CSF) of 26 patients with high-risk retinoblastoma, was studied. In this work the bone marrow (BM) was not evaluated, since ganglioside GD2 is expressed in this tissue as well as its synthase, reason that resulted in the search of a more specific marker. In the next part of this work, a more specific methodology intended to evaluate a more sensible and specific biomarker was designed. The selected molecular biomarker is a lineage-specific marker which corresponds with the transcription factor of the Cone-Rod homeobox-containing gene whose expression both in cells of primary retinoblastoma and also in disseminated cells was reported by other groups by immunohistochemistry, and ours by molecular techniques. Once this biomarker was selected as the most sensible and specific one, the next step was to study the detection of the CRX mRNA in the BM from those patients with metastatic retinoblastoma (n=17) who had metastatic disease at diagnosis (n=9) or at relapse (n=8), proven by biopsy, by means of a RT real time PCR (RT-qPCR) with the objective to use it as a tool for optimizing diagnosis and assessing treatment response by detecting the MDD. Subsequently, at a later stage of the study, t was analysed the use of CRX for MDD detection in MO and CSF samples of 96 patients (14 CSF were studied with GD2 synthase) with intraocular retinoblastoma (non-metastatic) and pathology risk factors. The aim was to assess whether the MDD was detectable in intraocular disease, to detect clinical or pathological characteristics that predict the MDD, and to evaluate their prognostic impact on disease-free survival (DFS). With the results obtained in the first part of the work it was demonstrated that the presence of GD2 synthase mRNA, and therefore of the MDD, is directly related to the risk of extraocular relapse. The foundations upon the concept of the MDD being present in the CSF of patients with retinoblastoma without CNS involvement at diagnosis were laid, especially in those who have massive involvement of the optic nerve and glaucoma; some of which can be saved with intensive therapy, supporting the need of more intensive protocols of sample collection. In the second part of this work, it was found that the mRNA of the CRX gene is a novel marker for disseminated retinoblastoma, which served as a tool not only to improve the identification of tumor cells at extraocular sites but also to elucidate the dissemination mechanisms of this tumor since CSF relapse would not be related with systemic dissemination of retinoblastoma in the light of the rapid, complete and sustained response of metastatic MO after induction chemotherapy. In all patients with secondary metastasis, relapse in CSF occurred regardless of what had happened in the MO, suggesting that the CSF would be a sanctuary site. In the last section, a sub-population of patients with "very high risk" and pathology risk factors who presented MDD and in whom the DFS is significantly lower despite intensive adjuvant therapy was identified. It was found that 10% of this sub-group of patients, who presents with clinically localized disease, actually already has molecular dissemination, especially those who had invasion of the optic nerve that was incompletely resected, and in those who presented with glaucoma. Finally, it was found that patients with retinoblastoma group E and glaucoma are at higher risk of having the MDD at diagnosis and should not be considered as candidates for conservative therapy.