Diseño de un nuevo vector para la transformación de cloroplastos de tabaco y su aplicación a la producción de antígenos de interés en medicina veterinaria

Abstract

Durante la presente tesis doctoral se generaron plantas transplastómicas de tabaco y se obtuvieron vacunas experimentales a partir de la expresión de antígenos de interés veterinario fusionados a la proteína decamérica y altamente inmunogénica lumazina sintasa de Brucella spp. (BLS). El primer antígeno expresado en este sistema fue la proteína VP8d (fragmento menor de 18,41 kDa derivado de VP8* que posee 27,54 kDa) de Rotavirus Bovino (RVB), cepa C486, fusionada a BLS (BLSVP8d-Bov). VP8*es una proteína no glicosilada de la cápside de rotavirus que además de ser un determinante importante de infectividad viral es un antígeno generador de anticuerpos neutralizantes. BLS forma decámeros y funciona como presentador para aumentar la inmunogenicidad de péptidos fusionados a su extremo N-terminal. Se generaron plantas transplastómicas que fueron exhaustivamente caracterizadas a nivel molecular por Southern, northern y western blot. BLSVP8d-Bov se comportó de manera altamente estable en cloroplastos. Los niveles más altos de acumulación se observaron en las hojas de mayor edad, representando al menos el 40% de la proteína soluble total de la hoja (PST) (4,85 mg/g tejido fresco [TF]). Este nivel de expresión fue 10 veces superior al obtenido en plantas transplastómicas generadas previamente en el laboratorio expresando VP8* de RVB. Independientemente de los altos niveles de expresión no se observaron diferencias fenotípicas respecto a plantas sin transformar. La fusión se mantuvo soluble en todo momento, pese a que VP8* forma cuerpos de inclusión insolubles al ser expresada usando el mismo sistema. BLSVP8d-Bov también se mantuvo soluble y estable en material liofilizado almacenado a temperatura ambiente. Adicionalmente, la inmunogenicidad de BLSVP8d-Bov fue evaluada con éxito en un modelo de gallinas ponedoras. Pudieron detectarse anticuerpos IgY específicos contra la fusión en la yema de los huevos obtenidos a partir de animales inmunizados con extractos solubles totales provenientes tanto de hojas frescas como liofilizadas. Dados los resultados alentadores obtenidos con BLSVP8d-Bov se decidió expresar también en el mismo sistema el antígeno VP8d de Rotavirus Equino (RVE), cepa H2, tanto solo como fusionado a BLS. En ambos casos se obtuvieron plantas transplastómicas fenotípicamente indistinguibles de plantas sin transformar, las cuales fueron caracterizadas molecularmente. Las proteínas recombinantes se mantuvieron estables y solubles tanto en hojas frescas como liofilizadas almacenadas a temperatura ambiente. Los niveles de expresión registrados fueron de alrededor de 2% y 4% de PST para VP8d-Eq y BLSVP8d-Eq, respectivamente (duplicándose en hojas liofilizadas), por lo que la fusión a BLS representa una estrategia potencial para aumentar los niveles de expresión de otras proteínas. Dado que BLSVP8d-Eq es inestable e imposible de producir en Escherichia coli las plantas representaron una alternativa más conveniente. La estrategia de fusión a BLS, evaluada por primera vez en plantas, representó una plataforma interesante para la producción de antígenos inyectables, o incluso orales, con inmunogenicidad potencialmente aumentada. La estabilidad de los antígenos recombinantes incluso en hojas liofilizadas podría traducirse en una reducción de costos y simplificar el procesamiento, purificación y almacenamiento, simplificando los esquemas de inmunización. Complementariamente, y de acuerdo a cuestiones de bioseguridad y percepción pública vigentes, se evaluó el gen de flavoxodina, que proporciona resistencia frente a estrés oxidativo o salino, como selector de plantas transplastómicas para reemplazar la selección por antibióticos. Entre otras dificultades, los usos de metil viológeno (propagador de superóxidos) o cloruro de sodio demostraron ser incompatibles con los procesos de regeneración empleados de rutina en el laboratorio, por lo cual sería muy difícil y poco conveniente intentar encontrar las condiciones para utilizar flavodoxina como gen selector primario. A la luz de estos y otros resultados, el gen de flavodoxina sería mejor aprovechado como un selector secundario alternativo para remover los genes selectores primarios clásicos que confieren resistencia a antibióticos.

During this PhD thesis we obtained transplastomic tobacco plants and experimental vaccines were derived from the expression of antigens of interest in veterinary medicine fused to the multimeric and highly immunogenic Brucella spp. lumazine synthase (BLS). The first antigen we expressed with this system was the VP8d protein (a smaller fragment of 18,41 kDa derived from 27,54 kDa VP8*) from Bovine Rotavirus (BRV), strain C486, fused to BLS (BLSVP8d-Bov). VP8* is a non-glycosylated protein of the rotavirus capsid and is the major determinant of viral infectivity and one of the neutralizing antigens. BLS is a decameric protein which can accommodate foreign polypeptides or protein domains fused to its N-termini, markedly increasing their immunogenicity. Transplastomic plants were obtained and characterized by Southern, northern and western blot. BLSVP8d-Bov was highly stable in chloroplasts. The highest expression levels were observed in older leaves, representing at least 40% of the leaf total soluble protein (TSP) (4.85 mg/g fresh tissue [FT]). This expression level was 10 times higher than the one obtained for transplastomic plants which were generated previously by our group and expressed VP8* from BRV. Despite the high expression levels, wild-type and transplastomic BLSVP8d-Bov plants were phenotypically indistinguishable from each other. The fusion always remained soluble and stable during all stages of plant development although VP8* aggregated as insoluble inclusion bodies when expressed using the same plant system. BLSVP8d-Bov remained soluble and stable even in senescent or lyophilized leaves stored at room temperature. The immunogenicity of BLSPVP8d-Bov was evaluated in a laying-hen model. Soluble protein extracts from fresh and lyophilized transplastomic leaves were able to induce specific neutralizing IgY antibodies in egg-yolk. Given the encouraging results obtained for BLSVP8d-Bov we decided to use the same system to express the VP8d antigen from Equine Rotavirus (ERV), strain H2, alone and fused to BLS. In both cases the transplastomic plants were phenotypically indistinguishable from their non-transformed counterparts. All plants were characterized by Southern, northern and western blot. The recombinant proteins remained stable and soluble both in fresh and lyophilized leaves stored at room temperature. The expression levels obtained were approximately 2% and 4% of TSP for VP8d-Eq y BLSVP8d-Eq, respectively (doubling in lyophilized leaves), for which fusions to BLS would represent a potential strategy to improve the expression levels of other proteins. It should be noted that since BLSVP8d-Eq was unstable and impossible to express in Escherichia coli plants represented a more advantageous strategy. The BLS scaffold was assessed for the first time in plants. It represented an interesting platform for highly immunogenic injectable, or even oral, subunit vaccines. Lyophilization of transplastomic leaves expressing stable antigenic fusions to BLS would further reduce costs and simplify downstream processing, purification and storage, allowing for more practical vaccines. Complementarily, and in accordance to the current public perception and biosafety concerns, we evaluated the use of the flavodoxin gene as a selectable marker for the production of transplastomic plants. This gene provides tolerance against oxidative and saline stress, among many others, which makes it an attractive alternative for the more traditional antibiotic-based selectable markers. Methyl viologen (a superoxide generator) and sodium chloride were not compatible with routine regeneration protocols and it would be difficult to adjust the proper conditions to use the flavodoxin gene for primary selection. Instead, we propose that this gene would be better suited as an alternative for secondary selection to remove the antibiotic-based genes previously used during primary selection.