Bases moleculares del mecanismo de regulación post-transcripcional asociado al sistema RsmZ/RsmE. Un estudio computacional

Abstract

Las proteínas de la familia Csr se encuentran presentes en el 75% de las especies bacterianas, y se estima que el 15% de los genes codificados en Escherichia coli son regulados por éstas. Su rol biológico está asociado a su capacidad de unirse a las regiones no traducidas (UTR) 5’ de ARN mensajeros (ARNm), modificando así su tasa de traducción. Entre los ARNm blanco de RsmE se destaca el gen hcnA, el cual codifica para una de las subunidades de la enzima responsable de sintetizar HCN en Pseudomonas protegens. Dicho metabolito actúa como un inhibidor natural frente a patógenos del suelo, por lo que las bacterias capaces de sintetizarlo proveen una protección natural a las plantas cuyas races habitan. Las homólogas de la familia Csr en el género Pseudomonas son nombradas con el prefijo “Rsm”. Éstas impiden la accesibilidad de la unidad ribosomal 30s al gen objetivo, de manera que la presencia de la proteína implica una represión en la expresión del ARNm. La familia Csr/Rsm es a su vez regulada por moléculas de ARN no codificantes y de secuencia corta (ARNp), capaces de capturar a la proteína y liberar al gen sobre el cual ejercen una función regulatoria. Los ARNp en cuestión poseen la misma secuencia consenso de unión que los ARNm capturados por Csr/Rsm, actuando así como inhibidores competitivos. Entre estos ARNp, RsmZ es el único cuya estructura ha sido caracterizada experimentalmente. En dichos trabajos a su vez se determino que RsmE se une cooperativamente los distintos bolsillos de unión de RsmZ siguiendo un orden definido. Contrariamente, estudios experimentales previos demuestran que RsmE se une a hcnA de manera anticooperativa. El objetivo de esta tesis es explicar dichos aspectos del sistema. Para esto, se presenta un análisis basado en simulaciones de Dinámica Molecular (DM) que explora la diversidad conformacional tanto de RsmZ como de los complejos RsmE-RsmZ y RsmE-hcnA. Los resultados revelan un patrón definido de exposición secuencial de los diferentes motivos de unión de RsmZ causado por la captura de las sucesivas unidades de RsmE. En conjunto, estas simulaciones brindan una explicación simple y consistente para el orden de unión observado experimentalmente, y cuyas bases moleculares no habían sido develadas hasta el momento. Además, se presentan modelos estructurales para los complejos RsmE-RsmZ parcialmente ocupados que no habían sido descritos de forma experimental al momento de realizarse esta tesis. Por otra parte, se implementaron simulaciones de Umbrella Sampling que describen el mecanismo de unión entre RsmE y el sitio de unión de RsmZ situado en una región simple cadena. El estudio estuvo enfocado en dilucidar cuáles son las interacciones más relevantes del proceso, estimando la energía involucrada en el evento de unión. Se observó que el motivo estudiado de RsmZ adquiere una estructura símil stem-loop durante el evento, y que para poder llegar a esa conformación es necesario que el segmento de simple cadena contenga al menos nueve nucleótidos. Asimismo, y mediante un Análisis de Componentes Principales (PCA) de ambas moléculas en su forma libre, se determinó que sus principales coordenadas colectivas tienden a generar las conformaciones propicias para la unión, sugiriendo fuertemente que la flexibilidad de la región monocatenaria de RsmZ afecta de manera crucial su capacidad para capturar a RsmE. Finalmente, se presentan resultados preliminares realizados para dilucidar el mecanismo de unión entre RsmE y el gen hcnA. Las simulaciones de Umbrella Sampling presentadas reproducen cabalmente los resultados experimentales y, por lo tanto, pueden ser luego aplicados a su racionalización. En conjunto, este trabajo presenta las primeras simulaciones reportadas tanto para el sistema de regulación post-transcripcional RsmE-RsmZ como para el complejo RsmE-hcnA, y se suma a los escasos antecedentes de técnicas de DM aplicadas al estudio de moléculas de ARNp.