Caracterización de los dominios de interacción de la proteína Gag del virus de la inmunodeficiencia de felinos

Abstract

El virus de la inmunodeficiencia de felinos (FIV) es un lentivirus que induce en gatos domésticos un síndrome de inmunodeficiencia similar al SIDA causado por el virus de la inmunodeficiencia de humanos (HIV). FIV no sólo es un patógeno de importancia para la medicina veterinaria sino que también es un modelo ampliamente utilizado de las infecciones causadas por HIV en humanos. FIV se ensambla en la membrana plasmática de las células infectadas como consecuencia de la multimerización de la poliproteína viral Gag. Esta proteína posee toda la información necesaria para el ensamblado de viriones. En efecto, nuestro laboratorio ha demostrado previamente que la expresión de Gag de FIV en células de mamífero resulta en la formación de partículas que son similares a los viriones inmaduros auténticos. Por otro lado, nuestro grupo ha establecido las condiciones que permiten que la proteína Gag de FIV producida en Escherichia coli se ensamble in vitro en partículas esféricas. Los viriones de FIV son liberados al medio extracelular por brotación a partir de la membrana plasmática de las células infectadas. Inicialmente, los viriones liberados exhiben una morfología inmadura. Luego, durante la brotación, el precursor Gag es procesado por la proteasa viral para dar las proteínas del virión maduro: matriz (MA), cápside (CA), nucleocápside (NC), así como el péptido espaciador p1 y el péptido C- terminal p2. Es interesante destacar que los roles estructurales y funcionales de las proteínas MA, CA y NC en el virión maduro son diferentes a los que ejercen como dominios de la poliproteína Gag durante el proceso de ensamblado viral. Nuestro laboratorio ha investigado previamente el rol de la MA y la NC en la morfogénesis de las partículas y en la infectividad viral. Sin embargo, nuestro conocimiento del ensamblado de FIV es aún limitado. En particular, las secuencias en el precursor Gag de FIV cuya interacción promueve la multimerización de esta proteína en partículas, no han sido todavía identificadas. El objetivo principal de esta tesis doctoral fue entonces mapear las regiones de la proteína Gag de FIV responsables de las asociaciones homoméricas que conducen al ensamblado de viriones. Para ello, generamos una serie de subdominios de Gag y estudiamos su habilidad para interactuar con moléculas de Gag de tamaño completo y ser reclutadas en partículas pseudovirales extracelulares. Al caracterizar el fenotipo de los distintos subdominios de Gag, encontramos que la deleción de los 37 residuos C-terminales de Gag así como la eliminación de las regiones amino y central de la NC atenúan pero no impiden la interacción con Gag salvaje. En cambio, un mutante de Gag que incluye a los dominios MA y CA exhibe un grado muy reducido de asociación con la proteína Gag de tamaño completo. La interacción con Gag es abolida al delecionar la mayor parte de la NC y los 40 aminoácidos N-terminales de la MA. Este mutante, al carecer de los motivos “dedos de zinc” de la NC y de la región polibásica de la MA, se hallaría impedido de interactuar con el ARN viral. En este sentido, nuestro laboratorio ha demostrado previamente que la asociación Gag-ARN viral es necesaria para el ensamblado de partículas tanto in vivo como in vitro. Al analizar el fenotipo de las proteínas maduras MA, CA y NC encontramos que ninguna de ellas se asocia con Gag salvaje. En cambio, cabe destacar que el subdominio CA-NC interactúa con Gag con gran eficiencia y es reclutado en partículas en una proporción cercana al 50 % de la masa proteica total de las partículas. Resultó interesante el fenotipo observado tanto para la proteína Gag a la cual se le introdujo una mutación que impide su miristilación como para la proteína Gag a la que se le eliminó el péptido C-terminal p2 que media la brotación de las partículas al medio extracelular. Al coexpresar cada uno de estos mutantes con la proteína Gag completa, encontramos que ambos exhiben un efecto transdominante negativo sobre el ensamblado de Gag salvaje. Finalmente, introdujimos una serie de deleciones internas en el dominio CA de Gag y encontramos regiones tanto en la porción amino como en la carboxilo que son necesarias para el ensamblado de las partículas virales. En su conjunto, nuestros resultados demuestran que la región CA-NC constituye el principal dominio de interacción Gag-Gag y que la capacidad de Gag de unir ARN viral es necesaria para su multimerización. Por otro lado, identificamos dominios en la CA de FIV cuya integridad es esencial para el ensamblado de Gag en partículas. Las investigaciones aquí presentadas contribuyen a una mayor comprensión del proceso de ensamblado lentiviral, el cual es un blanco potencial al cual dirigir estrategias antivirales que resulten de utilidad tanto para la medicina veterinaria como para la humana.