Bioreconocimiento sobre superficies poliméricas: aplicaciones en biotecnología

Abstract

Los materiales funcionales avanzados son altamente demandados por diferentes campos para una amplia variedad de aplicaciones. Campos que abarcan desde la biocatálisis hasta la cromatografía, y del diagnóstico hasta los sensores. La propuesta es obtener nuevos materiales con propiedades superficiales modificadas que establezcan una interacción específica con proteínas naturales y recombinantes. Estos materiales poliméricos tienen una aplicación directa en los sistemas de purificación de proteínas y en sistemas de diagnostico. Las radiaciones ionizantes son capaces de modificar la estructura de los materiales y en particular de los polímeros, ya que generan deficiencias electrónicas (excitaciones e ionizaciones). En este trabajo se utilizan distintas fuentes de radiación ionizante, ya sea de naturaleza corpuscular (electrones acelerados e iones pesados acelerados) como de naturaleza electromagnética (rayos γ), para modificar los diferentes polímeros en estudio. El objetivo específico de este trabajo es obtener nuevos materiales poliméricos macro porosos injertados con un copolímero de glicidilmetacrilato (GMA) y derivados de la acrilamida para mejorar la hidrofilicidad y accesibilidad de los ligandos a las proteínas. Para ello, se recurre a la modificación por injerto radio inducido mediante diferentes métodos de síntesis que permiten realizar sobre los materiales distintos grados de modificaciones. Entre ellos se encuentran: la pre-rradiación en vacío, la pre-irradiación en aire, y la técnica en simultáneo. Esta última técnica en particular también ser aplicada sobre nanoporos originados por trazas de iones pesados acelerados. En primera instancia, se modifican membranas de fibra hueca macroporosas de polieti- leno (PE) por el método de pre irradiación en vacío. En esta síntesis el injerto es iniciado por radicales libres que fueron previamente generados sobre el material por el bombardeo con haces de electrones acelerados (radiación β). Se evaluó la polimerización de monómeros de GMA y de GMA coinjertado con dimetilacrilamida (DMAA), incorporando fenil- alanina como ligando pseudoespecífico. Se obtuvieron grados de injerto del orden de 200 % y rendimientos en la conversión de grupos reactivos de hasta 64 %. También se observaron cambios significativos en las propiedades hidrofílicas de los materiales modificados. Luego, se estudia la modificación de PE poroso y no poroso (HDPE), incorporando AAm por medio del injerto radio inducido utilizando el método indirecto de peroxidación (en dos etapas). Los grupos peróxidos reactivos son generados sobre el material durante la primera etapa mediante la acción de rayos γ. Se obtienen % GI de hasta 80 % con AAm sobre PE poroso. Se observa del que el injerto de la poliAAm invade al PE produciendo la destrucción material. Posteriormente, se analiza la técnica de injerto en simultáneo sobre materiales de PE y de polisulfona (PSf ). Se incorpora GMA y GMA/DMAA y se derivatiza con IDA-Ni(II) y moléculas organoarseniacales (APA) como ligandos pseudoespecíficos. Se obtienen grados de injerto de hasta el 60 %, siendo el 20 %GI suficiente para el desarrollo del trabajo. Mediante las diferentes técnicas por injerto estudiadas se obtuvieron nuevos materia- les con propiedades superficiales diferentes debido a la incorporación de GMA, GMA-co- DMAA y AAm. Fue posible obtener materiales macro porosos con elevada concentración de grupos químicamente reactivos y con gran superficie interna de adsorción (red polimérica- ca tridimensional) aumentando el rendimiento en la inmovilización y en la capacidad de adsorción de este tipo de materiales. A través de la aplicación del coinjerto, aumentó 1,5 veces la concentración de ligando en todos las materiales GMA-co-DMAA con respecto a las membranas GMA, además fue obtenido un avance substancial en el mejoramiento de la hidrofilicidad y reactividad de los polímeros injertados. Cabe aclarar que no se ha logrado injertar DMAA como único monómero en las condiciones evaluadas, pero sí fue exitosa su incorporación junto con GMA. El injerto con GMA mediante la técnica en simultáneo también se utiliza para modificar superficialmente nanoporos perfectos de laminas de polietilentereftalato (PET). Estos nanoporos son obtenidos a partir de trazas latentes generadas por bombardeo con iones pesados acelerados. Se incorpora IDA-Ni(II) como ligando pseudoespecífico. Se obtienen capas homogéneas de poliGMA de aproximadamente 5 nm de espesor con un 1 % GI %. Estas diferentes técnicas estudiadas demostraron ser, en cuanto al grado de modificación, ampliamente superiores a la química de derivatización convencional. Una vez estudiadas las diferentes técnicas de injerto, obtenido y caracterizado los nuevos materiales funcionales avanzados, se prosigue entonces con la segunda parte de los objetivos propuestos: lograr obtener un sistema para inmovilizar proteínas recombinantes en forma orientada, a través de la unión a ligandos químicos unidos covalentemente a estos materiales poliméricos modificados con injertos de GMA y GMA/DMAA. En particular, investigaciones sobre la síntesis y la caracterización de este tipo de materiales fueron llevadas a cabo mediante el estudio de la modificación de PSf por la técnica en simultaneo incorporando químicamente ligandos de naturaleza arseniacal. Estos compuestos poseen afinidad por tioles cercanos como los que se encuentran en motivos estructurales del tipo Cys-X-X-Cys en proteínas como la Tioredoxina (Trx). El punto dominante de esta interacción es que presenta especificidad y requisitos estructurales. Los compuestos órgano-arseniacales fueron sintetizados, caracterizados fisicoquímicamente, y posteriormente se estudio, por diferentes metodologías, la interacción que presentan frente a ditioles de moléculas de bajo peso molecular como el DTT, BAL y con monotioles como el β-ME, entre otros. Se presenta el estudio de la interacción en el estado sólido de los diferentes ligandos arseniacales con Trx. Se evaluó y comparó la especificidad de unión así como las cinéticas de reacción mediante diferentes técnicas analíticas en función de la naturaleza del ligando y del pH. Finalmente, se evalúa la capacidad de unir específicamente proteínas de fusión a Trx y su potencialidad como soporte alternativo para su uso en kits de diagnóstico.