Aplicación tópica de liposomas ultradeformables para terapia fotodinámica contra Leishmaniasis cutánea

Abstract

La Leishmaniasis aun en el año 2009 sigue siendo un problema sin solución. Al presente existen 12 millones de personas infectadas en 88 países, con una incidencia de 2.000.000 personas infectadas/año, de las cuales 500.000 sufren leishmaniasis visceral, y el restante millón y medio leishmaniasis cutánea (LC). A diferencia de lo que ocurre en Europa y en África, la LC del Nuevo Mundo (América) no cura espontáneamente, y luego de tratamientos prolongados y dolorosos, donde se inyecta intra-lesionalmente la medicación, es posible que la enfermedad evolucione hacia la forma desfigurante e inhabilitante muco-cutánea. Convencionalmente, la LC se trata con soluciones de antimoniales pentavalentes (Glucantime, Pentostam), que son muy tóxicos y que además de generar resistencia, son poco efectivos para llegar hasta los nidos de amastigotes que se ubican en los fagosomas de los macrófagos de la epidermis profunda. Esta tesis presenta un nuevo concepto aplicable al tratamiento de la LC, que sería de máxima competencia como agente preventivo (antes de la aparición de las lesiones del estrato corneo (SC)): el empleo de terapia fotodinamica (TFD) usando luz del sol como fuente de energía, para eliminar los parásitos que se hallan a una profundidad máxima de unos 150 micrones de la superficie de la piel. Esta TFD, a diferencia de las convencionales, no se administraría parenteralmente sino tópicamente, es decir podría ser aplicada por el mismo paciente, en cualquier momento. También a diferencia de la TFD convencional, no seria activada por lasers, sino que solo requeriría de la luz solar para hacerlo. Esto es posible debido al enorme valor de la constante solar S de 80-100 mW/cm2. Una constante solar tan elevada permite, luego de una irradiación de tan solo 1 minuto, obtener una tasa de fluencia sobre la superficie de la piel de = 4,8-6 J/cm2. (En esta elaboración experimental, hemos tenido en cuenta que una tasa de fluencia de 2-3 J/cm2 es suficiente para que ftalocianinas de Aluminio dañen promastigotes y amastigotes axénicos de Leishmania spp.). Asimismo, las ftalocianinas tienen un máximo de absorción en la zona de los 680 nm, una longitud de onda cercana al NIR (near infrared). La irradiación en zona NIR es la que tiene máxima penetración en tejidos, por lo que estimativamente las capas celulares de la piel no interferirían en la absorción de ftalocianinas. Para conseguir que las ftalocianinas contacten los amastigotes de la epidermis profunda en la infección asintomática temprana, se las incorporará en nano-sistemas de entrega de drogas, (nanoSED), del tipo liposomas ultradeformables (LUD). El presente trabajo consistió en desarrollar liposomas ultradeformables (LUD) a los que se incorporaron ftalocianinas de Zn tanto hidrofilicas como hidrofobicas (ZnPc y ZnPcMet, respectivamente). Ambas ftalocianinas mantuvieron (–e incluso la ZnPc incrementó) su rendimiento cuantico de generación de oxígeno singlete una vez incorporadas en liposomas ultradeformables (LUD) (0,61 en LUD para ZnPcMet vs 0,8 en etanol) en tanto su rendimiento cuántico de fluorescencia se mantuvo bajo (0,20 tanto en LUD como en etanol para ZnPcMet) . Se concluyo en particular que la incorporación a LUD permitió incrementar la concentración de ZnPcMet en medio acuoso, manteniendo su estado monomerico. Asimismo, la ultradeformabilidad de los liposomas (medida como área bajo la curva de un gráfico de flujo de fosfolípidos vs tiempo, al extruir una suspensión liposomal a través de membranas de policarbonato de 50 nm poro bajo una presión de 0,8 MPa) quedaba intacta luego de la incorporación de ZnPcMet, siendo unas 30 veces más deformable que liposomas convencionales. A continuación, se determinaron tanto citotoxicidad sobre diferentes líneas celulares de mamífero, empleando métodos de MTT, LDH, así como inducción de stress oxidativo, tanto luego de iluminación (artificial a una densidad de energía de 15J/cm2) como en oscuridad. Estos resultados, que fueron publicados casi en su totalidad en International Journal of Pharmaceutics 330 (2007) 183–194, J. Montanari , A.P. Perez , F. Di Salvo , V. Diz, R. Barnadas, L. Dicelio, F. Doctorovich , M.J. Morilla, E.L. Romero, Photodynamic ultradeformable liposomes: Design and characterization nos permitieron avanzar sobre los aspectos relativos a la conservación de los LUD luego de su deshidratación. Remarcablemente, la deshidratación de LUD había sido un problema insoluble hasta el momento, ya que la clásica deshidratación en presencia de azúcares efectiva para liposomas convencionales, no es aplicable a las matrices LUD. El hallazgo de las condiciones adecuadas de deshidratación y una sencilla explicación de los resultados se publicó en International Journal of Pharmaceutics 372 (2009) 184–190. Montanari, D.I. Roncaglia, L.A. Lado, M.J. Morilla, E.L. Romero Avoiding failed reconstitution of ultradeformable liposomes upon dehydration Se desarrollo un modelo matemático que permitió calcular rápidamente el número de vesículas que componen una población liposomal, únicamente contando con datos de concentración lipidica y de tamaño de vesícula. La importancia de esta información, radica en que gran parte de la actividad citotóxica en general y leishmanicida en particular (excluyendo la toxicidad por acción superficial), puede adjudicarse al número de eventos endociticos/tiempo que llevan a cabo las células, y al número de vesículas disponible/volumen. Por lo tanto contar con un estimativo del numero LUD que se incuban en un experimento, permite ajustar con precisión las condiciones de trabajo de modo de hacerlas lo mas exactas posibles. Este modelo matemático ha sido enviado a publicar a Journal of Liposome Research (2009). Para determinar la profundidad de penetración de LUD vs liposomas convencionales, se adaptó el modelo de penetración de Saarbrücken al modo no oclusivo, y se llevaron a cabo incubaciones de 1 y 5 horas de LUD y liposomas convencionales marcados fluorescentemente tanto en su matriz lipídica como en su contenido acuso interno, sobre piel humana de origen quirúrgico. Esto se completó con la determinación de penetración sobre estrato corneo (SC) por tape stripping, del contenido acuso interno tanto de LUD como de liposomas convencionales. Se hallo que los LUD penetraban a través del SC, en tanto que los liposomas convencionales quedaban retenidos en la superficie del SC. Finalmente, y como prueba conceptual se determinó la actividad leishmanicida de LUD-FT sobre promastigotes y sobre amastigotes de Leishmania braziliensis, luego de 15 minutos de irradiación solar. Por primera vez pudimos demostrar una importante actividad leishmanicida para los promastigotes aplicando únicamente luz de sol. Restan ajustar las condiciones de irradiación sobre amastigotes en células de mamíferos, sobre los que se hallo una importante actividad citotóxica no fotoquímica de los LUDZnPCMET, que resultó entre dos y tres veces superior a la generada por la ZnPCMET cuando irradiada. Sin embargo, la prueba de concepto ha resultado más que exitosa si consideramos que estos resultados son los primeros que muestran como es posible cambiar rotundamente un tráfico intracelular de FT de modo de inducir toxicidad sobre un parasito intracelular como las leishmanias. Nunca hasta el momento se había empleado exitosamente la luz del sol como fuente de energía para eliminar parásitos de leishmania y estos resultados, además de originales, podrían generar un profundo avance en términos de terapéutica antiparasitaria eficaz y de fácil aplicación para una endemia que afecta tanto a América como a África y Europa mediterránea. Estos resultados, junto con los de penetración en piel se han enviado a publicar a Journal of Controlled Release, 2009.